基因乙肝疫苗的制备工艺

清歌一曲月如霜

基因乙肝疫苗的制备工艺 

摘要：乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即一种乙肝病毒外衣壳蛋白，并非完整病毒。这种表面抗原不含有病毒遗传物质，不具备感染性和致病性，但保留了免疫原性，即刺激机体产生保护性抗体的能力。乙肝表面抗原曾经是从乙肝病毒携带者的血液，经纯化灭活等严格工序制备而来，即血源性疫苗，该疫苗由于安全、来源和成本等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血浆)。基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技术生产的，即构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒，然后转染相应的宿主细胞，如酵母、CHO细胞，生产乙肝表面抗原蛋白。利用重组酵母生产的叫重组酵母乙肝疫苗，利用CHO细胞生产的叫重组CHO乙肝疫苗，剂量为每支5微克。它们都可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感，
都可以放心选用。
 
     关键词：乙肝病毒，疫苗，基因，生物药品  
1.目前国内乙肝疫苗市场 
   目前国内乙肝疫苗市场主要由北京天坛生物、深圳康泰、上海生研所和华北制药金坦生物制品公司四家占有。其中北京天坛生物、深圳康泰采用默克公司公司酵母基因工程技术生产，上海生研所和华北制药金坦生物制品公司采用哺乳动物细胞（CHO细胞）技术生产。 
 乙肝疫苗按照生产工艺分为两大类：血源乙肝疫苗和基因乙肝疫苗。基因乙肝疫苗又可分为酵母基因工程乙肝疫苗与哺乳动物细胞基因工程乙肝疫苗（CHO）。为了防治血源性感染，卫生部规定2001年以后全部使用基因工程乙肝疫苗，目前我国市场上销售的乙肝疫苗都是预防性基因乙肝疫苗。天坛生物的基因工程乙肝疫苗是从美国默克公司引进的全套生产技术和生产工艺，产品为酵母基因工程乙肝疫苗。  
2.目前乙肝疫苗生产工艺 
2.1概述 
 在世界范围内，酵母生产的基因乙肝疫苗由于成本较低，工艺成熟，取得了支配地位。现有的基因工程乙肝疫苗都具有良好的免疫效果，从产量来说，史克必成的高（60mg/l纯品），而默克的低（5mg/l纯品）.酵母乙肝疫苗发酵工艺较成熟，但乙肝抗原不能分泌，需要破碎菌体后纯化抗原，因此需要发酵一批纯化一批，而且纯化工艺复杂，回收率低，估计综合成本约2元/每支（在中国生产），国内目前出厂价每人份2.5~4元。 
2.2酵母重组技术 
    基因工程乙肝疫苗（酵母重组）能有效阻止乙肝的传播。它通过主动免疫的方式使人获得对乙肝的抵抗力。大量临床资料表明：它是一种安全有效的制品，它的抗体阳转率在95%以上，母婴阻断率在85%以上，它能降低乙肝感染率、携带率，成为控制乙肝的一种重要手段。 
 基因工程乙肝疫苗（酵母重组）有着远高于血源乙肝疫苗的母婴阻断效果。在四川对2228名双阳性孕妇母婴阻断效果进行了观察，结果为5μg基因工程乙肝疫苗（酵母重组）阻断效果超过了国产30μg血源乙肝疫苗。此结果在以后的母婴阻断试验中均得到了验证。 
基因工程乙肝疫苗（酵母重组）因是一个新产品，有关免疫持久性试难仍在进行之中，从所观察5年资料看，可以保护5年，是否能保护更长时间沿需实验证实。科学研究表明：基因工程乙肝疫苗（酵母重组）可刺激人体产生免疫记忆反应，因此，长期受益是可能的。

2.3基因乙肝疫苗的生产原理： 
 基因工程乙肝疫苗（酵母重组）是一种乙肝表面抗原（HbsAg）亚单位疫苗，它系采用现代生物技术将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建，克隆进入啤酒酵母菌中，通过培养这种重组酵母菌来表达乙肝表面抗原亚单位。 
 基因工程乙肝疫苗（酵母重组）的生产工艺包括发酵、提取、纯化、吸附、配制、分装等工序。生产工艺中采用世界一流的发酵罐，通过全自动控制，提供酵母菌最优生长条件，发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品抗原蛋白纯度达99%以上。所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌，有效地减少了种种人为因素的干扰，确保生产稳定和质量一致性。  基因工程乙肝疫苗（酵母重组）质量控制：基因工程乙肝疫苗（酵母重组）严格按照美国默克公司质量标准进行质量控制，生产单位建立了全面质量管理体系，产品原辅材料、半成品、成品检测和环境检测等方面均有严格质控标准和检定程序。 
3.乙肝疫苗质检情况 
    乙肝血源疫苗的生产,从原材料人血浆的筛选、超离心纯化到半成品和成品检定,每一环节都要求有严格的质量监控。从疫苗的安全性考虑,在疫苗成品和半成品中,以国家检定部门规定的敏感方法不应查出Da。氏颗粒的存在。按现行规程要求,含抗原的原液经蔗糖速率离心后,按HBsAg峰分段收集HBsAg,然后对曲线峰临界点附近各样品管中的样品进行电镜检查,经电镜判定为多见短杆偶见长杆或含有Dane氏颗粒的样品则不能进行合并,从而保证疫苗的安全性。此外,对蔗糖离心后样品,还必须以同位素(3 H dTT夕)掺人法检查DNA多聚酶(DNA一P)活性。 以电镜法判断Dane氏颗粒能存在虽然比较可靠,但仍受到制样操作及观察判定等人为因素的影响;而DNA一P活性检查,其敏感性、特异性仍存在很多问题。近年来证实以分子杂交技术检测HBV DNA的存在,是目前最敏感、最特异的手段。 
 目前国家食品药品监督管理局SFDA批准进行临床试验的有且只有以下4种：① 高剂量乙型肝炎疫苗 60μg/1.0ml)，估计二期B（IIb期）临床试验已完成，现进度未明；② 抗原抗体复合物治疗性乙型肝炎疫苗 (乙克60μg/1.0ml)，三期临床试验开展中；③ 治疗性乙型肝炎合成肽疫苗，将进入三期临床试验；④ 双质粒治疗性乙型肝炎DNA疫苗，2006年获特殊批准开展一期临床试验,一期和二期同时进行中,二期会在2009年中完成。我国另有数个治疗性乙型肝炎疫苗正在研究中。  
参考文献： 
[1] Mochizuki M. Growth characteristics of canine pathogenic viruses in MDCK cells cultured in RPMI 1640 mediumwithout animal protein[J]. Vaccine, 2006, 24(11) :1744-1748. 
【2】2 Alper CA．The human immune response to hepatitis B surface antigent【J】．Exp Clin lmmunogenet， 1995，12：171． 
【3】Azeneth Barrera，Bernadette Guerra，Lena Notval et a1．Lanford Mapping of the Hepatitis B Virus&#160rc—S 1 Domain Involved in Receptor Recognition【J】．Hepatology,2005，8：9786—9798． 
【4】Jones C D，Page M，Bacon Aet a1．T-cell and antibody response characterization of a new recombinant preS 1，preS2 and SHBs antigen containing hepatitisB vaccine：demonstration of superior anti-SHBs antibody induction in responder mice【J】．Vaccine，1999，17：2528—2537． 
【5】5&#160range R，WerrM，BriknerM，et a1．Properties of modified hepatitisB virus surface antigen particles carrying preS epitope【J】．J Gen Virol，1995，76：2131"--'2140． 
【6】Davis H C，MichelM L，Mancine M et a1．Direct gene transfer in skeletal muscle plasmid DNA based immunization against the hepatitisB virus surface．【J】．Vaccine，1 994，1 2：1 503． 
【7】李琪玲．前S2蛋白与乙型肝炎病毒复制的关系[J】．现代中西医结合杂志，2005，．14(22)：30—35． 【8】Kuroda S，Fujisawa Y Iino S et a1．Induction of protection level of anti-pre-S2 antibodies in humans immunized with a novel hepatitis B vaccine consisting of M(pre-S2+S)protein pat-ricles(a third generation vaccine)[J]．Vaccine，1991，9(3)：1 63． 
【9】Prange R，Werr M．DNA-mediated immunization to hepatitisB virus envelop proteins：Pre S antigensecretion enhances the humoral respanse【J】．Vaccine，1999，17：617． 
【1 0】Panchol&#160’Lee D，Liu Aet a1．DNA prime／canary pax boost-busetd immunotherapy chronic hepatitisB virus infection in a chimpanzee[J】．Hepatology,2001，33：448． 
【l l】Soussan只Poi S，Garrean F et a1．Vaccination of chronic hepatitis B virus carriers with preS2／S envelope protein is not associated with the emergence of envelope escape mutants【J】．J Gen Virol，200 1， 82：367．

tsingsea

参考文献好神奇的说！

lidezhong

tsingsea 发表于 2014-1-22 13:51
参考文献好神奇的说！

参考文献从来就看不懂的飘过         

tsingsea

lidezhong 发表于 2014-1-22 14:07
参考文献从来就看不懂的飘过

我能看懂编号和表情

lidezhong

tsingsea 发表于 2014-1-22 14:10
我能看懂编号和表情

好吧，我只看得懂表情

tsingsea

lidezhong 发表于 2014-1-22 14:31
好吧，我只看得懂表情

你数学老师喊你回去罚站！