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本帖最后由 沁人绿茶 于 2015-3-11 07:30 编辑
前段时间看了某位蒲友发了个帖子，问培养基灌装的温度为什么要先低温再高温，能不能先高温再低温。刚刚看了这个帖子，心里有些不在意，怎么还有人问这个问题，真是新人。准备回给他，因为大家就是这么做的。但是想想，自己身为版主，一定要以理服人，随便找个资料，教育教育这位朋友，要多查资料，少问问题，自己学会找到解决问题的方法。 对于验证，首先想到的资料自然是有着验证圣经之称的《制药工艺的验证》（2012年版，中文翻译版），翻开第22章，制剂生产的无菌工艺：组织与验证，培养时间和温度章节（page 365）中，是这么描述的“培养时间及温度在许多公司里面曾经一度是具有更多争议及变化的做法之一（4，11)。所选的方法包括7 天培养后从一个温度转移到另一个温度的多种温度下的培养。人们甚至困惑，是否开始应在一个较高的温度[ ( 3 0 ～3 5 )]培养然后转人较低的温度[ ( 2 0 ～2 5 )] , 或者开始在一个较低的温度培养然后移到一个较高的温度。不管所选的真实条件如何，人们已认识到促生长试验必须进行，这种认识导致采取了一个更广泛的明确的做法，即培养温度可以在20~35内变化，其中还包括1 4天内进行单一温度的培养。假如选择的温度是同样的（通常范围是亇2.5°C)，使用一个培养温度易于进行模拟灌装并伴有良好的促生长结果，是适用的。该做法使方法具有了灵活性，因此可以适应微生物复活的最大可能。”
第23章药用化学品无菌工艺验证，培养检查章节（page 376）的描述是“除了与获得待培养物料相关的复杂性（或者是大量的可以检查的洁净容器或是一个单一的膜过滤器，促生长培养基），培养这些物料是容易解决的。物品放在一个25 ~35 培养箱里（在某个单一的温度，所有的地点在2 .5°以内）培养14天。可以使用替代的培养方法，如果促生长要求能得以满足的话。培养后容器检查使用的方法与最后制剂所用容器的方法相类似，允许使用大规格的容器。在完成检测后，检测中所用培养基的样品应该有其促生长特性的确认。”
第24章，手动无菌工艺验证，培养时间和温度（page383），中的描述是可采用23章的方法。 汗，这不科学啊，完全和以往的认知不同啊，要是把这段引用了，不是显得俺经验主义了，但是俺肯定也没记错啊，难道是资料没有找对？嘻嘻，小版我除了肉多兄弟多，就是资料多了，对于工艺验证，权威的技术资料莫过于PDA的指南了，于是俺翻开箱底，找到了PDA22、PDA28及PDA62号报告。 PDA22号报告（2011年版）： 7.13 Incubation Conditions Prior to incubation, filled APS units should be inverted or manipulated to ensure contact of the medium with all internal surfaces of the closure system before they are incubated. APS units should be incubated for a minimum of 14 days unless supported by another qualified duration/method.The temperature chosen should be based upon its ability to recover microorganisms normally found in the environment or in the product bioburden. A single incubation temperature in the range of 20-35°C may be used (6). Data should be available to show the suitability of the selected incubation temperature to support growth. The selected temperature should be controlled and monitored continuously throughout the incubation period. PDA28号报告： 见附图
PDA 62号报告（2013年版）：
8.10 Incubation Time/Temperature培养时间/温度 The same incubation methods used for a u t o m a t e d machine-based aseptic processing are appropriatefor MAP and can b e f o u n d in PDA Technical Report No. 22 (6): 用于自动机械无菌工艺的培养方法也适用于MAP，可以查看TR22： Prior toincubation, units should be inverted, and swirled or manipulated to ensure contact of the mediumwith all internal surfaces of the closure system before they are incubated. Process simulation units should beincubated for a minimum of 14 days unless supported by another qualified duration/method. The temperaturechosen should be based upon its ability to recover microorganisms normally found environmentally or inthe product bioburden. A single incubation temperature in the range of 20-35 癈 may be used. Data shouldbe available to show the suitability of the selected incubation temperature to support growth. The selectedtemperature should be controlled and monitored continuously throughout the incubation period. 在培养之前，灌装的单元要倒装、翻转或者其它操作来保证培养基与密封组件整个内表面接触。工艺模拟的培养基至少培养十四天，除非有其它确认过的时间或者方法。温度的选择基于温度要能使环境常规发现的微生物或产品生物负载的微生物能够复活。可以使用20-35℃范围内的单一培养温度。要有数据说明选择的温度能够支持生长。选择的温度要在培养期间持续控制盒监测。
嗨，真是不看不知道，一看吓一跳啊，可以从PDA的指南中看到，PDA其实并没有规定培养基灌装的温度一定要在两个不同温度下进行培养，如果有培养基促生长的数据，在20-35的温度范围内选择一个温度也是可以的。（汗，上帝保佑老板别看到，俺打的报告建的两个培养室啊）。 小版是打不死的小强，俺就不信俺错了，记得火星人也写过一篇类似的文章，引用的是PIC/S的指南，俺再看看去： PIC/S PI 007-6 RECOMMENDATION ON THE VALIDATION OF ASEPTIC PROCESSES 2011年1月1日发布 5.3.1 It is generally accepted to incubate at 20-25°C for a minimum of 7 days followed immediately, or after a first reading, by incubation at 30-35°C for a total minimum incubation time of 14 days. Other incubation schedules should be based on supporting validation data. 通常在先在20~25°C下至少培养7天，然后在30-35°C的温度下总共培养至少14天是可以的。其他培养计划应当基于支持性的数据。 小版终于找到了先低温再高温的理论来源了，虽然PIC/S也没有禁止其他的培养条件，但是至少小版不会被老板扣那本来就不多的奖金了。 小版继续找啊找，终于又在箱底找到一个指南 Guidance Media Fills for Validation of Aseptic Preparations for Positron Emission Tomography (PET) Drugs 2012年4月，这个指南虽然不是直接针对药品的，但是也有一定的借鉴作用。C. What are the steps involved in a media fill? 下有一段描述。After the final product container is filled and ready for release, it should be incubated in a temperature-controlled incubator. Although USP <71> recommends incubation at 20o– 25oC for the aerobic growth medium, as a practical matter any controlled temperature between 20o and 35oC would work for media fills. However, the “controlled temperature” should be specified in your procedures and be maintained within a range that does not exceed ±2.5 ±2.5oCoC. The incubation period of a media fill should be no less than 14 days and the containers should be examined every 2 or 3 days. 从上面可以看出，FDA和PDA的观点基本一致，都是可以选择20-35度间的一个温度做为培养条件，当然前提条件是必须做了促生长的实验。
综合以上，我们可以得到结论：
1.培养基灌装的培养温度可以在进行完培养基的促生长实验后，选择一个20-35度的温度进行培养，但是培养箱的温度需要控制在 ±2.5oC.
2.对于培养温度的先后问题，目前除了PIC/S的指南外，没有其他指南明确了先后，先后顺序一样需要促生长实验的结果支持。
俺可以得到的教训是： 1. 师傅未必都是对的，还需要看教材到底怎么说的，当然一本教材也未必是对的，最好看原始的资料来源或者多看几本教材。 2. 人云亦云易，探索求真难，希望大家不仅仅是得到答案，在得到答案后，最好再去求个真。
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发表于 2015-3-10 23:59:53
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发表于 2015-3-11 06:41:45
楼主
谢谢参与讨论，另外，您能把US CGMP的guidance的具体是哪个指南提供一下么？从这个指南中，FDA也并未说一个温度条件不可以！
