人云亦云易，探索求真难（培养基灌装的培养温度到底是多少？）

青城/怒云

uiofer 发表于 2015-3-11 12:29
《制药工艺验证》第二版中，就提到了这种做法！

呵呵

青城/怒云

uiofer 发表于 2015-3-11 12:28
首先，我并不否认两种培养温度的做法，因为很多企业都是这么做的。而且我所在的公司，也一直都是这么做的 ...

不怕真专家
就怕真砖家

叶非

《制药工艺的验证》第二版，可能有的朋友不多，把完整版的23章放上来，供大家讨论时参考！另外把网友提到的Guidance for Industry Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing —Current Good Manufacturing Practice一起附上！
这里并不是想一定争论出谁对谁错，大家可以各抒己见，一起谈谈对这个事情的看法。

ensign75

uiofer 发表于 2015-3-11 12:28
首先，我并不否认两种培养温度的做法，因为很多企业都是这么做的。而且我所在的公司，也一直都是这么做的 ...

一般来说，细菌在30-35度适宜生长，霉菌在20-25度适宜生长，这是选择两种温度的最主要的原因，所以工业界比较通用的做法是先在20-25度培养7天，检查是不是有污染，然后在放到30-35度再培养7天。中间检查的原因并不是为了要风险使用（至少我知道罗氏，诺华和BMS不是为了这个目的），而是为了更早的知道是不是有大规模的污染，可以早点采取措施，并且中间检查也是为了让培养基和瓶塞，瓶壁有更充分的接触（检查时和灯检一样，需要倒转，要培养基浸润全部内表面，灌装结束后开始培养之前也要做这个检查），在后7天培养时有的公司采用倒置的方式。

法规中没有说一定要两种温度，也可以采用一种温度，但是这里面就涉及到了验证的问题，需要做大量的实验来证明典型的细菌、霉菌、酵母菌在你选择的温度下都能生长良好，并且从你们公司里日常环境监控采样发现的菌也要在这个温度下生长良好，这个并不容易做，即使做了，不同的检查员的看法也不统一，没有哪个公司愿意在培养基模拟灌装验证中给挑出毛病。实际上有人做过，效果并不好，如果你们做过对比实验，把相同量的菌液接种到TSB中，放在不同的温度下培养，生长情况是不一样的，特别是在培养基灌装量比较少的时候，有时候你很难区分是培养基的浑浊还是微生物污染。所以从风险控制的角度来说，2种温度培养更可靠。

因为微生物的污染有很大的随机性，没有哪个一定就好，哪个一定就坏，但是整个验证的设计要从风险控制的角度来尽可能的挑战灌装工艺，提高检测的可靠性和灵敏度，并不是说只要培养结果没有染菌，就证明工艺肯定没问题。如果本身设计就有问题，也可能运气好最终得到合格的结果。培养基模拟验证是用来证明设计合理的工艺的稳定性和可靠性，不是用结果来给不合适的操作的找理由的，但是往往后一种情况经常出现。

yangjin7309

如果分两个温度同时培养，那灌装的样品就要翻番了，考虑经济与适用性。而且结果判断是污染了没，不是以真菌或细菌等种类判定的，是让各种菌能充分生长后综合判定。个人见解

叶非

yangjin7309 发表于 2015-3-12 14:23
如果分两个温度同时培养，那灌装的样品就要翻番了，考虑经济与适用性。而且结果判断是污染了没，不是以真 ...

进行菌种鉴定的目的是为了判定污染的来源。真菌和细菌的争论并非是想判定菌种，而是为了因为两个温度的原因正是针对的两种不同菌的合适温度不同，而来的差异。

大呆子

小叶太牛了，在微信上看了，追根溯源，写的非常好

叶非

ensign75 发表于 2015-3-12 10:38
一般来说，细菌在30-35度适宜生长，霉菌在20-25度适宜生长，这是选择两种温度的最主要的原因，所以工业界 ...

1.我认为你的问题有点跑题了，我们现在讨论的是培养基灌装的合适温度是什么，以及原因。
2.几个问题和你探讨下，对于培养基灌装的检查，更多的公司的做法是每天或者至少每三天检查一次，检查的目的是为了能够及时的发现异常，进行相关调查，而并非只是做7天的检查。另外，对于制剂，我接触到的公司都是从培养基灌装培养开始，就进行倒置培养，而非是到了最后。
3.培养基的促生长实验，在进行培养基灌装前和灌装后都需要进行，使用的菌落也是药典规定的典型菌和日常监控的环境菌，唯一的区别是，在进行霉菌类的检查时，放置在20-25度，而做培养温度验证时，我把所有的都放置在30-35度或者其他某一个固定温度，这点根本不会增加工作量。另外，我对你说的实验设计很感兴趣，你们做的对比实验是如何对比的？温度设置是如何做的？促生长的标准是怎么定的？生长情况不一样，这是肯定的，但是不代表不在可接受范围内。至于你说的，培养基灌装时，灌装量较小时，无法区分培养基浑浊还是微生物污染，这点和温度有什么关系？你们的培养基灌装的OOS是如何做的？你们培养基为什么浑浊？如果装量少，影响到了观察，你应该做的是培训人员或者重新设计你的装量。
4.培养基灌装本身就从来没说培养基灌装是保证无菌的，它只是证明你的无菌保障值在可接受的范围内。我同意你说的，培养基灌装不是给不合适的操作找理由，但是你还是没说明白，为什么一个温度不合适，而两个温度合适。我还要说，20-25度的温度对细菌有抑制作用，你应该在20-25度培养7天，再到30-35度培养14天才合理，这样才是最保险的做法。

yangjin7309

版主分析总结的好

ensign75

uiofer 发表于 2015-3-12 22:24
1.我认为你的问题有点跑题了，我们现在讨论的是培养基灌装的合适温度是什么，以及原因。
2.几个问题和你 ...

我说的是从风险评估的角度来讲，考虑到检测的可靠性和灵敏度，2个温度比1个温度更加合适。这就像统计学上的置信区间一个道理。如果你的促生长实验做得彻底，能够证明一个温度没问题，那你就按照一个温度做。对于没有明确要求在GMP条款里的东西，如果你有足够的证据来支持你的结论，从科学上合乎逻辑，讲的通就可以了。现在的GMP检查本来就是基于风险评估和控制的，你只要能把你的话讲圆了，就没问题。

另外对于每天或每三天检查来说，我并不认为检查的频率越高越好，因为你检查需要把培养基搬出来，每批至少5000瓶检查也不是一时半会，频繁的检查，来回晃动培养基会影响微生物的生长，特别是如果微生物比较脆弱，灌装量比较少的时候。

灌装量少不是因为不想多灌，而是因为制剂本身的容器规格就小，现在很多生物药的装量都不大，这样就限制了培养基的装量，你可以试试看，同样10CFU的对照菌加到装有0.7ml培养基的安瓿（1ml安瓿）和7ml培养基的西林瓶（15ml西林瓶）中，然后放到不同的温度下培养，看看7天或者14天后的生长情况，就能看出区别。

我不知道你从哪里了解到“20-25度的温度对细菌有抑制作用”？对大多数细菌来说，20-40度都是可以生长的，相对来说，30-35更有利，但是20-25并不会抑制。

叶非

ensign75 发表于 2015-3-13 14:39
我说的是从风险评估的角度来讲，考虑到检测的可靠性和灵敏度，2个温度比1个温度更加合适。这就像统计学上 ...

1.检查的时候为什么要把培养基搬出来，现在更多的公司的做法是建立培养室，在培养室内观察就好了。而且并非所有的培养基在检查的时候都需要进行晃动，只是在发现了有可疑的长菌和浑浊的时候，才会晃动，以判断是否是长菌。。
2.你原来说的是灌装量少，是无法判断是培养基浑浊还是长菌，这个和你加多少菌有什么关系？制剂的培养基灌装是以是否长菌来判定，又不是以使长几个菌来判定，所以，我还是不明白你想表达的同一个容器中，长一个菌和长两个菌的差异对于判定培养基灌装的结果有什么作用。判定长几个菌，是后续调查的内容。
3.20-25度的温度对细菌有抑制作用是我表达的不准确。20-25度下，细菌的生产会比较缓慢。

观沧海

多谢分享

wang103103

我理解楼主的真实意思是：在GMP实践中不断思考，人云亦云易，真正通过实践证明的做的很少。我们在执行GMP中可能丢失了GMP的理念。我们注重的是法规执行，不侧重研究和证明，是国内企业通病。

叶非

wang103103 发表于 2015-3-14 11:16
我理解楼主的真实意思是：在GMP实践中不断思考，人云亦云易，真正通过实践证明的做的很少。我们在执行GMP中 ...

不太对，我想告诉大家的恰恰是遇到问题，不要迷信其他公司是如何做，或者某个大牌是怎么说的，弄清楚法规的要求或者技术资料的 要求，而不要人云亦云！

罗伊鲱

放个更早的

叶非

roadman 发表于 2015-3-17 16:56
放个更早的

1987年的，您老厉害！

四叶花

确实遇到过类似的困惑，可没楼主想的那么深刻，学习了

pyshixi

中国的制药企业需要借鉴国外优秀的指南，但是国内药企也需要你们高专业知识人才开拓一条适合我们炎黄子孙的指南道路啊

zeal602

我关注这个问题，主要是因为我们车间没有专门的培养室，所以我就考虑采用一种温度，通过空调系统来控制。在这个温度下，进行培养基灌装前后的微生物促生长实验。也是看了PDA TR22之后坚定了这种想法。目前我们初步定在28℃，波动在2.5℃范围内。前期做的促生长实验没有问题，希望后期的实验也别出问题。没办法，也是为了替老板省钱。。

叶非

zeal602 发表于 2015-3-26 16:44
我关注这个问题，主要是因为我们车间没有专门的培养室，所以我就考虑采用一种温度，通过空调系统来控制。在 ...

我认为，重点在于你的促生长实验的条件是否和你的培养基灌装的培养条件一致。