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本帖最后由 歪把子 于 2021-7-3 19:22 编辑
以下内容来自FDA官网(2020.8.25;第二修订版),顺带看了一下,很细致。 翻书不易,全册92页;暂未看完。 欢迎点击专业认可、交流讨论; 原版请去官网下载,好像是免费。 不过论坛版主已经放上来了 ,链接如下
已在药品VIP群放置word版,VIP只需点赞,不用再收集。 悄悄告诉你,2014年版本有人整完放在论坛了,链接如下。等不及的可以先看这一版。
13.第九章:环境监测 可能需要ORS微生物学家在制药设施现场视察期间协助CSOs对这些设施进行环境监测(EM)取样,以评估关键表面的微生物负荷。本章描述了执行此活动的建议程序。,这只能作为一种指南,根据ORS总部的特别指示或设施的特殊性必要时作一些修改。请务必与ORS总部确认哪些ORS实验室指定接收环境监测样品。这些程序允许对被监测的关键工序或实验室区域的微生物存在的环境监测样品进行定性和定量评估。 A:材料/设备 1. 取样材料(对带入前室、洁净室或公司指定的配制/加工区域的所有材料进行消毒。) a.包含无菌输送介质溶液的无菌聚酯或棉签。 b.可折去手柄的无菌海绵 c. *接触或等效表面取样器 d. *RODAC/接触板(转移被检生物体和计数) *使用含有卵磷脂和吐温的概念中和剂的培养基 e.无菌 袋 f.盛装于螺旋盖容器中用于冲洗的无菌水或无菌生理盐水。 g. Dey/Engley (D/E)中和肉汤 h.Letheen肉汤 i.盛装于喷雾瓶中的无菌消毒剂 j.装载于喷雾器或湿巾的70%无菌酒精 k.黑色记号笔(永久性、细尖)。 l.数码相机 2. 检测设备及材料 a.具有HEPA过滤的生物安全柜(BSC) b.带HEPA过滤的层流罩(LFH) c. 10%漂白剂或适当的消毒剂/杀孢子剂 d.无菌的70%乙醇(ETOH)或异丙醇(IPA) e.无菌袖 f.无菌手套 g.发网 h.实验大褂/无菌大褂 i.胡须罩和/或面具 j.设置在32.5oC±2.5oC的培养箱。设置在22.5oC±2.5oC的培养箱。 k.改良Letheen肉汤(MLB) l.改良Letheen琼脂(MLA) m. 沙氏葡萄糖肉汤 n.SDA o.含氯四环素麦芽提取物琼脂 p. 含5%羊血琼脂的TSA q.麦康凯琼脂 r.RODAC碟 s. 接触®接触片 t.大豆酪蛋白消化琼脂(TSA) u.大豆酪蛋白消化肉汤(含中和剂) v.中和剂(如卵磷脂、吐温等) b .取样准备 1. 请适当使用以下个人防护装备: 注意:在进行采集之前,所有的ORS都应依照程序进行全套更衣。进入洁净分级区域时应遵守公司的程序/指引;然而,为了进行取样,期望进入分级洁净区域的微生物学家穿上无菌服装。如果对无菌取样时所穿的个人防护用品有争议,应在开始更衣前联系ORS总部。 a.非无菌发网和胡须套(如有需要) b.无菌面具 c.鞋套(非无菌) d.无菌手套 e.一次性无菌工作服 f.无菌头罩 g.无菌护目镜 h.无菌靴套 2. 取样设备控制 a.无菌操作技术质控:将一(1)个无菌涤纶或棉签放入无菌水中,再放入无菌输送介质溶液中。将阴性对照品放入无菌 袋中。 注意:如果海绵和/或棉签是预先湿润的,则可能不需要这种控制。这个控制没有表面接触。 b.拭子/海绵无菌性质控:将未使用过的拭子(或海绵)单元放入无菌袋中。 c. RODAC/接触无菌性质控:将未使用的RODAC板和/或接触板放入无菌 袋中。 d. 袋无菌性质控:包括一个未开封的 袋作为一个封闭的质控样本。 e.手套无菌性质控:如果取样者使用ORS无菌手套,则将一个包含手套的完整单元放入无菌塑料袋中作为对照。 f.设备无菌性质控:包括在EM取样时使用的任何其他无菌设备(即无菌标本杯、无菌培养基等)。(不需要包括工作服、口罩和靴套)。 C.EM采样程序 建议调查组带定性和定量环境监测方法的设备。使用海绵/拭子定性方法用于难以到达的区域。rodac或接触被用于计数开放式平面工作表面微生物的定量方法。在整个集合中每个分析人员均执行相同的规则。(例:一名分析师收集样本,另一名分析师担任助理。)请参阅本程序E节中列出的建议取样位置。 1. 用适当的消毒剂(如杀孢子剂或70%无菌酒精)消毒戴手套的手。 a.在每个EM样本之间重复此步骤。 b.将手套晾干,以免消毒剂从手套上滴落。 c.一些拭子/海绵取样包包括第二套无菌手套。在这些情况下,次级手套可以无菌地放在初级手套之上,以加快取样过程。不应摘除备用手套,但应根据需要添加备用手套并进行消毒。 d.对ISO 5位置进行采样时: i.核实LFH/BSC确认是否有效。 ii.在开始取样前,允许LFH/BSC运行大约10分钟 iii.在放入LFH/BSC之前,用适当的消毒剂擦拭所有外部采样容器 iv.不要在LFH/BSC外打开取样材料 2. 定性擦拭 a.打开无菌棉签(或海绵)。用润湿剂(无菌水、生理盐水或D/E中和肉汤)浸湿,通过挤压放置润湿剂的容器内部来挤出多余的水分。 b.用力将拭子(或带手柄的海绵)涂在被监测的表面(或设备)上。 c.在取样(监测)时,允许拭子(或带手柄的海绵)在平面上牢固地摩擦约24 - 30平方厘米的区域。 d.在接触区域内水平和垂直方向涂抹拭子(或海绵)约10秒。 e.将拭子(或海绵)放回运输容器(如果附带)并放入额外的无菌袋。一定要断开海绵涂抹棒的手柄部分。 3.定量RODAC / 接触抽样 a.小心地取下RODAC板的盖子或松开接触滑动管的盖子。小心不要接触琼脂表面。 注:检查琼脂是否有污染或脱水 b.对取样区域施加适度、均匀的垂直压力,轻轻地但紧实地用RODAC琼脂表面触摸,然后小心地更换盖子。避免在样品处使平板被摩擦,因为这可能会破坏琼脂。 c.当使用接触时,将针压下,使铰链线处的桨弯曲,轻轻地降低滑动片,用牢固均匀的压力将琼脂压到表面。使用第2个琼脂表面,在靠近初始测试部位的区域重复此步骤。在容器中更换滑块并紧密关闭。 4. 不规则表面的采样 分级洁净区域可能有裸露的不规则表面(如不平整表面、纹理表面、锻压部件,不耐色表面等),需要取样。在这种情况下,在取样之前,应使用无色的运输介质,如letheen肉汤、无菌生理盐水或无菌水来湿润海绵或拭子。微生物学家应避免使用深紫色的D/E中和肉汤,它可能使不规则的表面变色。 根据微生物学家的判断,可以确定应该使用RODAC板对不规则表面进行取样。在这种情况下,由无色琼脂如胰蛋白酶大豆琼脂组成的RODAC板是合适的。应避免使用彩色琼脂,如D/E琼脂。 5. 将EM样本放入无菌 袋,然后立即在袋外做好标识。 6. 为样本指定一个连续的编号(如1、2、3等),此外还要包括日期、样本所在位置(请具体说明)和你的姓名简签。在检查记录簿中记录拭子编号和拭子位置。 7. 采样后,采样区域用70%无菌酒精消毒。可使用无菌无棉绒擦拭,以帮助清除取样残留物和加速取样区域的干燥。 8. 尽快将双袋短节放置在隔热冷却器内,用预冷冻的凝胶包保持样品低温,但不要冷冻,并在收集后的24小时内将样品运到服务实验室进行分析。 9. 将样品放入适当的转运容器中,以防止压碎或对拭子造成物理损害。容器应具有一定的保温能力,以防止极端温度(冻结或过热)。 10.关于待处理样品,请提前与接收实验室联系。这将确保他们在48小时内有合适的人员和材料进行样品收集。 D.推荐的环境监测点 在检查时,不允许公司在取样前对工作区域进行消毒。设施和设备应在公司相关工艺运行过程中进行取样。拭子上的消毒剂可减少微生物负载或增加肉汤培养期间的抑制作用。收集EM样品时,应从最受控制的位置(ISO 5- HEPA过滤的LFH/BSC或隔离器)开始,并移至控制程度较低的区域(工作台外但仍在房间内的区域)。 1. 拭子擦拭受控工作区内经常使用的表面,例如: a. LFH或隔离器内液体袋挂钩 b.工作面中心 c.隔离手套的指尖和袖子 d.蠕动泵 e.工作台内的储物箱 f.工作台内的置物架或任何其他文具 g.设备控制面板,包括LFH/BSC的开/关开关 h.用于分隔多个工作面的柔性塑料窗帘 2. 在HEPA过滤工作站内擦拭角落缝隙。 3.擦拭存放于洁净室或工作台上用于喷洒(即70%酒精、消毒剂溶液等)的任何瓶子的手柄、扳机和喷嘴。 4. 擦拭工作台前的椅子下面。具体来说,在前底部边缘,人员将抓住拉起椅子。 5. 在产品容器或消毒后的产品可能被放置在HEPA过滤工作站外的控制室内的拭子台或工作台。 6. 擦拭每一个高效空气过滤器过滤工作站的进气口网格。通常位于装有导流过滤器的装置的顶部。 7. 在产品制造或配液的设备送风处,擦拭与设备送风相连接的房间空气处理系统的排(回)气网格。 8. 擦拭洁净室的电灯开关、把手或进出门把手以及电话或对讲机底座。 9. 擦拭任何纸箱、塑料容器把手、工具(压线钳)或剪刀、称重秤上的键盘、计算器或放在洁净室的电脑、键盘、鼠标和触摸屏显示器。 10.对生产或配制过程中人员所穿的旧服的外部袖口进行拭子。它们可能挂在试衣间的入口处。 11.在洁净室的水平窗台底部用棉签擦拭。 12.擦拭打开或脱落的天花板下的任何区域。 13.样品区域的变色,污渍或水和油滴。 14.根据你的判断力取样任何其他高风险的地面位置。 15.拍摄显示明显污染迹象(如颗粒物质、真菌、变色等)的表面或设备。试着照片影像包括一个目标区域的远距离图片和一个聚焦的特写。这样的位置务必取样。 E.由ORS实验室进行分析准备 1. 拭子的所有处理必须在HEPAII级过滤生物安全柜(BSC)或HEPA过滤等级优于收集拭子的等级内无菌进行。 2. BSC或LFH内的所有表面必须用芽孢消毒剂彻底消毒,然后用无菌过滤的70%乙醇或IPA消毒,然后将拭子放在罩下并开始分析。 3.为了确保BSC/LFH和培养基没有微生物污染,无菌检测的标准开闭质控品应与分析同时进行。 4. 请适当佩戴以下防护用品: a.一个发网。 b.一次性实验服 c.无菌一次性袖 d.无菌手套 e.面具/胡罩 f.实验室安全眼镜 5. 在每一个棉签处理之间,无菌手套必须进行消毒。无菌手套和袖子应丢弃,并根据需要更换。 6. 样品制备 a.检查拭子容器的封闭完整性,以确保没有发生篡改、泄漏或潜在的交叉污染。 b.仔细消毒每个拭子容器的外部,并放置在消毒的BSC/LFH中,让其风干。 7. 介质-培养基的选择 a.中和添加剂(例如吐温/聚山楂酸酯、卵磷脂等)用于中和取样过程中转移到拭子上的抑制性消毒剂残留物,这些残留物可能抑制微生物生长。 b.对于微生物的广谱回收,利用含有中和剂的营养丰富的培养基(general-purpose media;即MLB, MLA等)。 c.当仅针对真菌种群时,需要使用适当的真菌培养基,如沙氏葡萄糖或麦芽提取物培养基。使用抗生素(如金霉素)是有益的,它将有助于选择性地抑制细菌的生长,并限制更快速生长的霉菌菌落的大小和高度。 d. 5%羊血琼脂的TSA有利于培养营养需求苛刻的微生物。 e. MacConkey琼脂用于革兰氏阴性菌和肠道菌的分离和分化。 f. RODAC板和接触玻片用于微生物污染的检测和定量。 F.分析程序 1. 大约100ml无菌培养基,MLB或其他合适的培养基,应无菌地添加到每个包含方形海绵拭子的塑料袋中。彻底混合或旋转。 2. 大约10ml无菌培养基,MLB或其他合适的培养基,应无菌地添加到无菌容器中,并将拭子及其传输介质加入其中。彻底混合或旋转。 3.所有拭子在25oC- 30oC至少孵育14天,以允许潜在应受损生物复苏。 4. 接触玻片和RODAC板应及时在30-35oC下孵育2天,然后在20oC-25oC下孵育5天。当怀疑污染物生长缓慢时,可能需要较长的培养期。每天检查菌落的形成,以减少因过度生长而模糊了较小菌落的可视化(可计数性)。 a.计数并记录RODAC板菌落形成单元数。每个菌落类型的代表斑点都应该被挑选出来,并重新进行纯度检测,然后进行鉴定。 b.计算接触滑梯划桨两侧的菌落数量。报告桨的每一侧的菌落计数,并挑选所有菌落类型的代表株并重新标记纯度,随后进行鉴定。 5. 每天检查所有棉签/海绵的浊度,并进行继代培养,观察浊度。所有传代培养必须在LFH或BSC下进行。如果容器不允许浊度观察,则在第5天至第7天对所有环境样品进行传代培养。所有的环境样本将在第14天培养后进行继代培养,而不考虑之前的继代培养。 6. 将所有EM样本传代到非选择性培养基(如MLA等)和选择性/鉴定培养基(如MacConkey琼脂,MEA等)的组合上。建议将5%羊血琼脂TSA作为不同的传代培养基之一。至少使用两个应该琼脂,其中之一必须是非选择性琼脂。 a.真菌培养基应在20o~ 25o下培养5 ~ 7天。在某些情况下,延长孵化时间可能是适当的,但一般不超过14天,除非有具体的科学理由。 b.所有其他培养基在30o- 35o条件下培养2 - 3天。 7. 重新培养所有培养拭子,直到完全孵育(14天)。 8. 所有阴性对照,如系统对照、培养基对照,在与样品相同的条件下培养。 9. 采样人收集、提交的质控品应在与样品相同的条件下处理和孵育。 10.根据USP<1113> ”微生物特性,鉴定和菌株分型“作为指导,进行微生物特征描述和鉴定。通常,快速鉴定系统(即VITEK)是在初步筛选和表征完成后使用。如果不能通过生化测试获得可接受的鉴定,其他鉴定平台如DNA测序可能是有益的。
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