细菌内毒素的检测及验证

m1213995776 · 发表于 2021-9-19 12:12:54

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我是是医疗器械公司，目前细菌内毒素这块不是很懂，公司规定结扎血管夹细菌内毒素限值是＜0.5EU/g，用0.06的鲎试剂做，样品浓度是0.12g/ml，用凝胶法检测，操作是，样品实验：0.1ml水+0.1ml样品溶液。阳性实验：0.1ml水+0.1ml 0.12EU/ml工作品。供试品阳性实验：0.1ml样品溶液+0.1ml 0.12EU/ml工作品。阴性实验：0.2ml水。这样操作下来的检测结果符合规定嘛？我看药典里样品实验好像是不加水，直接0.2ml样品溶液。还没有做过内毒素验证，我们公司经常是先有标准，后面补做方案，补方案的时候只做两个厂家一个批次样品的干扰实验这样子可以嘛？我看论坛里有人发验证都说要做3批，可是我已经做了好几个1批样品的内毒素验证了，而且验证里我直接就说明用哪个鲎试剂做哪种浓度样品的干扰实验，这样的方案对吗？还有最近做了注射用聚左旋乳酸微球内毒素验证，样品浓度0.05g/ml(这是使用浓度，就是一定要配制成这个浓度才能使用，不然注射后没效果)，鲎试剂0.5EU/ml，标准限值是10EU/g，做凝胶法干扰实验，A，B溶液全部凝固，C，D溶液不凝固，是样品浓度太高了？需要再稀释嘛？该如何操作啊？还有不超过MVD的稀释倍数该怎么算（就是我代入鲎试剂，样品浓度，标准限值算出来的数据基本都是1，我们公司基本上内毒素的MVD都是1）？求大神解答

野风吹北 · 发表于 2021-9-19 12:43:00

你们结扎夹有细菌内毒素要求？你们还做聚乳酸填充物，涉猎这么广，没有专业生物人才啊？

m1213995776 · 发表于 2021-9-19 14:09:40

野风吹北发表于 2021-9-19 12:43
你们结扎夹有细菌内毒素要求？你们还做聚乳酸填充物，涉猎这么广，没有专业生物人才啊？

没有专业微生物人才，公司要求有点高，我们都是去年疫情公司没办法，才招进来先做着，以前有个专业微生物的人，可是走了，到别处高就去了

野风吹北 · 发表于 2021-9-19 14:12:26

让老板找人，这不花钱，想搞三类也太简单、太容易了吧？

m1213995776 · 发表于 2021-9-20 11:37:19

野风吹北发表于 2021-9-19 14:12
让老板找人，这不花钱，想搞三类也太简单、太容易了吧？

就是老板不肯啊

有所思CJ · 发表于 2021-9-20 13:07:25

“结扎血管夹细菌内毒素限值是＜0.5EU/g，用0.06的鲎试剂做，样品浓度是0.12g/ml，用凝胶法检测，操作是，样品实验：0.1ml水+0.1ml样品溶液。阳性实验：0.1ml水+0.1ml 0.12EU/ml工作品。供试品阳性实验：0.1ml样品溶液+0.1ml 0.12EU/ml工作品。阴性实验：0.2ml水。这样操作下来的检测结果符合规定嘛？”

限度＜0.5EU/g 样品浓度0.12g/ml，换算成样品溶液限度＜0.06EU/ml
你如果要用0.06的鲎试剂检测，样品组应该加0.2ml样品溶液；阳性样品组应重新取一支内毒素标准品，使用样品溶液稀到内毒素含量0.06EU/ml，然后取此溶液0.2ml加入鲎试剂；否则就换0.03鲎试剂

有所思CJ · 发表于 2021-9-20 13:11:13

“补方案的时候只做两个厂家一个批次样品的干扰实验这样子可以嘛？我看论坛里有人发验证都说要做3批，可是我已经做了好几个1批样品的内毒素验证了，而且验证里我直接就说明用哪个鲎试剂做哪种浓度样品的干扰实验，这样的方案对吗？”

我们是一个鲎试剂厂家做三次产品内毒素方法适用性检查，因为只买了一个厂家的鲎试剂，以后要用其他厂家鲎试剂就再重做方法适用性检查

有所思CJ · 发表于 2021-9-20 13:22:19

样品浓度0.05g/ml(这是使用浓度，就是一定要配制成这个浓度才能使用，不然注射后没效果)，鲎试剂0.5EU/ml，标准限值是10EU/g，做凝胶法干扰实验，A，B溶液全部凝固，C，D溶液不凝固，是样品浓度太高了？需要再稀释嘛？该如何操作啊？

AB溶液全部凝固，本来正常情况下0.25那组是不凝固的，可能是样品中的内毒素本来就很高，也可能是你的样品成分就会导致鲎试剂凝固还需要继续稀释，直到样品浓度不会导致凝胶反应，稀释倍数只要不超过MVD就行。（医疗器械的样品溶液配制过程我不清楚，如果是药品的话就是这样考虑的）

C溶液不凝固是指全部不凝固吗？至少2倍那组是要凝固的啊！

有所思CJ · 发表于 2021-9-20 13:32:01

“还有不超过MVD的稀释倍数该怎么算（就是我代入鲎试剂，样品浓度，标准限值算出来的数据基本都是1，我们公司基本上内毒素的MVD都是1）？”

MVD=cL/入
c为供试品浓度，和你们医疗器械供试品溶液配制有关。
L为限度，一般固定
入为鲎试剂灵敏度，和鲎试剂选择有关。
你们公司产品MVD都是1应该是因为以前的师傅建立检测方法的时候把供试品溶液配制成c，和选用的鲎试剂入刚好可以直接实验，不需要稀释。
可以从增大c和减小入建立新检测方法

m1213995776 · 发表于 2021-9-22 11:37:50

有所思CJ 发表于 2021-9-20 13:32
“还有不超过MVD的稀释倍数该怎么算（就是我代入鲎试剂，样品浓度，标准限值算出来的数据基本都是1，我们公 ...

是的，以前的师傅就是这么教我们的，就没教我们怎么算MVD，我现在想可不可以把0.05g/ml当成样品原液1（因为这个冻干粉是固体，使用的时候，一定要配置成0.05g/ml才能使用），按照MVD公式，L是10EU/g，鲎试剂0.5EU/ml，那我最大的稀释倍数是20倍，也就是我把0.05g/ml的样品稀释20倍，也就是0.0025g/ml，再去做干扰试验，如果还不合格，那就换鲎试剂，这样子行吗？还是有别的办法能确定样品没有干扰的稀释倍数，不一定要稀释20倍，那该怎么操作啊？

有所思CJ · 发表于 2021-9-22 13:14:50

m1213995776 发表于 2021-9-22 11:37
是的，以前的师傅就是这么教我们的，就没教我们怎么算MVD，我现在想可不可以把0.05g/ml当成样品原液1（因 ...

C=0.05g/ml
L=10EU/g
入=0.5EU/ml
计算得到MVD=1
意思是你的0.05g/ml已经不能继续稀释了，如果想稀释换鲎试剂，然后重新做干扰实验。

m1213995776 · 发表于 2021-9-22 13:34:00

有所思CJ 发表于 2021-9-22 13:14
C=0.05g/ml
L=10EU/g
入=0.5EU/ml

我已经试过了，还是不行。你看看我这样子对的吧？我直接做干扰试验里的溶液A，就是直接加0.2ml样品溶液，如果不凝固，就说明浓度可以了吧？现在领导让我再去买浓度更低的鲎试剂再试一下

有所思CJ · 发表于 2021-9-22 13:41:34

m1213995776 发表于 2021-9-22 13:34
我已经试过了，还是不行。你看看我这样子对的吧？我直接做干扰试验里的溶液A，就是直接加0.2ml样品溶液， ...

是的，再试试更低的鲎试剂。

xksbennie · 发表于 2021-9-22 14:53:27

“我是是医疗器械公司，目前细菌内毒素这块不是很懂，
公司规定结扎血管夹细菌内毒素限值是＜0.5EU/g，用0.06的鲎试剂做，样品浓度是0.12g/ml，用凝胶法检测，操作是，样品实验：0.1ml水+0.1ml样品溶液。
阳性实验：0.1ml水+0.1ml 0.12EU/ml工作品。
供试品阳性实验：0.1ml样品溶液+0.1ml 0.12EU/ml工作品。
阴性实验：0.2ml水。这样操作下来的检测结果符合规定嘛？”
标准的操作不是这样的，是先用0.1mL无内毒素水复溶，再加0.1mL样品或PC或PPC；
样品浓度和试验浓度是不一样的，如果你直接配制的浓度是0.12g/mL，那样品浓度和试验浓度都是0.12g/mL，否者需要稀释，然后才有计算MVD；
当然我不建议你直接使用0.12g/mL作为样品浓度，因为试验的时候需要配PPC，样品浓度至少是使用浓度的2倍，即MVD至少为2；（也有不稀释的情况，如测试注射用水的内毒素）
可以使用0.25g/mL作为样品浓度，0.125g/mL作为是使用浓度，用0.06EU/mL（实际是0.0625）的鲎试剂；

“我看药典里样品实验好像是不加水，直接0.2ml样品溶液。”
不是，先用0.1mL无内毒素水复溶，再加0.1mL样品或PC或PPC；以厂家说明书为准；因为如果直接加有内毒素的溶液，会影响凝固结果；

“还没有做过内毒素验证，我们公司经常是先有标准，后面补做方案，补方案的时候只做两个厂家一个批次样品的干扰实验这样子可以嘛？我看论坛里有人发验证都说要做3批，可是我已经做了好几个1批样品的内毒素验证了，而且验证里我直接就说明用哪个鲎试剂做哪种浓度样品的干扰实验，这样的方案对吗？"
一个厂家，3个批次；2个厂家，各做3各批次；

”还有最近做了注射用聚左旋乳酸微球内毒素验证，样品浓度0.05g/ml(这是使用浓度，就是一定要配制成这个浓度才能使用，不然注射后没效果)，鲎试剂0.5EU/ml，标准限值是10EU/g，做凝胶法干扰实验，A，B溶液全部凝固，C，D溶液不凝固，是样品浓度太高了？需要再稀释嘛？该如何操作啊？“
这个要与灵敏度试验的结果对照来看，如果你的灵敏度结果也是这样的，就没问题；

”还有不超过MVD的稀释倍数该怎么算（就是我代入鲎试剂，样品浓度，标准限值算出来的数据基本都是1，我们公司基本上内毒素的MVD都是1）？求大神解答“
这个不用太纠结，存在这种情况一般是有干扰，增大稀释倍数然后用更高灵敏度的鲎试剂做试验就可以；

xksbennie · 发表于 2021-9-22 14:56:06

m1213995776 发表于 2021-9-22 13:34
我已经试过了，还是不行。你看看我这样子对的吧？我直接做干扰试验里的溶液A，就是直接加0.2ml样品溶液， ...

单从结果来看，是有一定程度的干扰；
但是你这个结果有问题；一般来说，不应该连续几个梯度都存在稍有凝固的现象；我估计是你们再保温之前没有摇匀；

m1213995776 · 发表于 2021-9-23 09:52:41

xksbennie 发表于 2021-9-22 14:56
单从结果来看，是有一定程度的干扰；
但是你这个结果有问题；一般来说，不应该连续几个梯度都存在稍有凝 ...

保温之前都是漩涡混合了30秒的

m1213995776 · 发表于 2021-9-23 09:54:15

xksbennie 发表于 2021-9-22 14:56
单从结果来看，是有一定程度的干扰；
但是你这个结果有问题；一般来说，不应该连续几个梯度都存在稍有凝 ...

除了用0.25鲎试剂，样品浓度0.125g/ml是拿起来就流动的，其余都是第一下倒置不流动，再重复看就流动了

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