小奕说药丨关键质量属性（CQA）评估（2）：蛋白A残留

奕安济世生物药

蛋白A残留

蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，它能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段，所以常常使用蛋白A的色谱柱来分离纯化单克隆抗体。天然的蛋白A由信号序列（S）、5个IgG结合结构域（E、D、A、B、C）和细胞壁附着区（X、M）组成，结构示意图如下：

目前大多数工程蛋白A在天然序列上进行改造，从而提高蛋白A填料的结合能力，延长填料寿命、耐温性和稳定性，以提高其在暴露于苛刻条件（如原位清洁（CIP）洗脱中的碱性pH环境和IgG纯化步骤中的酸性pH环境）后的耐受性[1]。例如高碱性稳定性的MabSelect SuRe，以及更高载量的MabSelect PrismA。

但是当应用蛋白A亲和层析进行抗体纯化时，蛋白A依然能够从填料中析出，尤其是当其循环使用而老化时，脱落的蛋白A容易导致抗体的污染，对抗体药物的安全性和有效性具有潜在的隐患。因此国内外监管机构对于蛋白A残留出台了一些相关规定。

国内外法规对于蛋白A残留的规定

《中华人民共和国药典》2020年版第三部《人用重组单克隆抗体制品总论》3.2.4 工艺相关杂质章节中提出“采用适宜的方法对供试品宿主蛋白质、宿主细胞和载体DNA、蛋白A及其他工艺相关杂质进行检测。供试品测定结果应在规定的范围内。”；以及《尼妥珠单抗注射液》3.1.3.3 蛋白质A残留量中提出“用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，蛋白质A残留量应不高于蛋白质总量的0.001%”。

关于国外，美国FDA[2]提出在定量检测蛋白A时，应尽可能使用高度灵敏的分析方法，并且结果应低于该方法可检测水平。USP130《PROTEIN A QUALITY ATTRIBUTES》表示，“在纯化人用抗体时应清除滤出的蛋白A，并相应验证生产工艺。 基于酶联免疫吸附试验(ELISA)的残留检测通常用于工艺开发和验证，以确保在蛋白A亲和层析后的工艺步骤中有效去除残留蛋白A。 此外，制造商应通过原材料鉴定和色谱柱寿命研究，对树脂和配体质量有清晰的了解和记录”。

蛋白A残留的CQA评估

以下我们将通过既有知识，对一般情况下的蛋白A残留对于药物的安全性和有效性的影响评估进行论述，并通过PQAA评估工具进行风险评分（评估工具在往期的文章中有过介绍，参见小奕说药：《关键质量属性（CQA）评估（1）：蛋白质聚集》），最终确定蛋白A残留是否属于CQA。需要说明的是，依据既有知识的评估结果无法替代具体产品的实际情况，所以这里只是一种评估演示。

1、安全性

金黄色葡萄球菌是一种主要的人类病原体，与以多形核白细胞（PMN）为主的炎症为特征的各种类型的局部和全身感染有关。葡萄球菌经常引起肺炎，这些临床分离株通常有蛋白A的表达增加，这表明蛋白A可能在毒力中起作用[3]。

有研究者发现通过TNFR1的蛋白A信号传导是金黄色葡萄球菌诱导肺炎的主要途径[3]。蛋白A通过激活TNFR1通路，诱导PMN动员清除气道中的细菌，但代价是造成PMN相关的上皮损伤和呼吸损害。

还有研究表明[4] ，金黄色葡萄球菌蛋白A（SpA）是金黄色葡萄球菌在小鼠感染性关节炎中的毒力因子。通过分别对小鼠接种野生型菌株和SpA缺乏型菌株，发现相比于SpA缺乏型菌株，在野生型金黄色葡萄球菌感染的小鼠中导致更严重的关节炎和脓毒性死亡的疾病结果。基于蛋白A残留具有较高的免疫原性，因此对于免疫原性评分为“7（重大）”。

Prosorba是将高度纯化的蛋白A共价结合到硅胶树脂上的一种装置，用于体外清除血浆中IgG后回输患者，适用于治疗特发性血小板减少性紫瘫和类风湿性关节炎。研究表明[5]，Prosorba柱浸出蛋白A无不良反应。对食蟹猴的研究表明[6]，每周体内静脉注射高度纯化的SpA 100 μg/kg的剂量后，连续12周， 食蟹猴也无明显不良反应。因此对于非免疫安全性评分为“1（不显著）”。

2、有效性

如果蛋白A与抗体药物一起存在时，预计会结合抗体的Fc结构域，并影响药效和药代动力学（PK）。由于并非所有浸出的蛋白A都是完整的[7]，因此对效价的评分为“5（中等）”。

还有相关文献报道[8]，SpA或其低分子量片段B可降低小鼠IgG的半衰期。Dima[8]等人提出SpA屏蔽了IgG分解代谢位点，损害了该位点的功能。将金黄色葡萄球菌放射标记蛋白A静脉注射小鼠和兔子体内形成可溶的[(IgG)2-(SpA)1]2复合物。复合物在小鼠和兔子体内的半衰期比在动物体内相应的游离IgG的半衰期短得多（可高达15倍）。因此对药代动力学（PK）的评分为“5（中等）”。

3、风险评分

综上，依据既有知识并采用PQAA评估工具，对蛋白A残留的最终风险评分为7分（详见下表），因此蛋白A残留属于蛋白质药物的关键质量属性。

参考文献

[1] Zarrineh M ,  Mashhadi I S ,  Farhadpour M , et al. Mechanism of Antibodies Purification by Protein A[J]. Analytical Biochemistry, 2020, 609:113909.

[2] Points to consider in the manufacture and testing of monoclonal antibody products for human use (1997). U.S. Food and Drug Administration Center for Biologics Evaluation and Research. J Immunother. 1997 May;20(3):214-43.

[3] Gómez, Marisa I,  Lee A ,  Reddy B , et al. Staphylococcus aureus protein A induces airway epithelial inflammatory responses by activating TNFR1.[J]. Nature Medicine, 2004, 10(8):842-848.

[4] Palmqvist N ,  Foster T ,  Tarkowski A , et al. Protein A is a virulence factor in Staphylococcus aureus arthritis and septic death[J]. Microbial Pathogenesis, 2002, 33(5):239-249.

[5] Balint J P ,  Jones F R . Evidence for proteolytic cleavage of covalently bound protein a from a silica based extracorporeal immunoadsorbent and lack of relationship to treatment effects[J]. Transfus, 1995, 16(1):85-94.

[6] Bernton E ,  Haughey D . Studies of the safety, pharmacokinetics and immunogenicity of repeated doses of intravenous staphylococcal protein A in cynomolgus monkeys.[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2014(5).

[7] Carter-Franklin J N ,  Victa C ,  Mcdonald P , et al. Fragments of protein A eluted during protein A affinity chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1163(1-2):105-111.

[8] Dima S ,  Medesan C ,  Mota G , et al. Effect of protein A and its fragment B on the catabolic and Fc receptor sites of IgG[J]. European Journal of Immunology, 1983, 13(8):605-614.

[9] Amritkar V ,  Adat S ,  Tejwani V , et al. Engineering Staphylococcal Protein A for high-throughput affinity purification of monoclonal antibodies[J]. Biotechnology Advances: An International Review Journal, 2020(44-):44.

胜利者

学习了

奕安济世生物药

胜利者 发表于 2023-3-14 13:10
学习了

cmx1997

学习了，谢谢大佬