靶向 NONO 的小分子药物重塑致癌基因转录组——陶术化合物库

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据CA cancer J clin最新数据，前列腺癌已占美国新发癌症病例的27%，正式超过肺癌成为危害男性健康最严重的恶性肿瘤。雄激素受体（Androgen receptor，AR）是前列腺癌的重要驱动因子，其与雄激素结合后可以调节下游基因的表达，从而促进前列腺癌的进展和转移，这也是前列腺癌药物靶点之一。

雄激素剥夺治疗（Androgen deprivation therapy；ADT）是晚期前列腺癌主要的治疗方法，AR 拮抗剂（如 enzalutamide）是目前治疗前列腺癌的一线药物，但大多数患者对这些药物容易产生耐药性。

开发 AR 的小分子降解剂是对抗耐药性的常用方法，例如靶向嵌合体的蛋白水解，但这些候选疗法可能无法治疗有雄激素配体结合位点突变的癌症，也无法治疗产生截短剪接变异体（例如完全缺乏 AR 配体结合域的 AR- v7）的癌症。

将 mRNA 翻译为蛋白质需要经过一系列的步骤，包括转录、剪接、转运和修饰。这些过程中的每一步都受 RNA 结合蛋白 (RBPs) 的控制。RBPs 通过调控关键致癌蛋白 mRNA 的成熟参与许多人类疾病，并发挥着重要作用，但在化学探针和药物发现方面仍需要充分的探索。

发现 RBPs 的小分子调节剂面临一些挑战，包括缺乏传统的药物结合口袋，以及功能检测方法有限，然而针对特定 RBP 和 RBP-RNA 复合物的化学探针和药物的最新研究表明，以 RBPs 为靶点的药理学治疗具有广阔的潜力。识别 RBPs 的化学探针可以提供一种方法来抑制多种疾病相关蛋白的表达和活性，包括致癌转录因子，如前列腺癌的主要驱动因子雄激素受体 (AR)。

2023 年 3 月 2 日，美国加州拉霍亚斯克里普斯研究所 Benjamin F. Cravatt 团队在 Nature chemical biology 发表了研究 Remodeling oncogenic transcriptomes by small molecules targeting NONO，通过筛选发现了在前列腺癌细胞中快速降低 AR 及其主要剪接异构体表达的小分子(哌嗪氯乙酰胺 B21)，并通过化学蛋白质组学鉴定 B21 的蛋白质靶点 NONO，阐明了 B21 通过 RNA 结合 RBP 蛋白 NONO，选择性地抑制了全长 AR (AR-FL) 和剪接变异体 AR-v7 的转录和蛋白表达，为治疗前列腺癌提供的一种新思路。

抑制 AR 表达的亲电子化合物 B21 及其类似物

亲电子化合物可与不同结构和功能分类的蛋白质形成共价作用，研究人员通过对半胱氨酸定向亲电小分子聚焦筛选，发现一种 α-氯乙酰胺化合物 B21 及其类似物，可以选择性地抑制全长 AR (AR-FL) 和剪接变异体 AR-v7 的转录和蛋白表达。

图a. 抑制AR转录和蛋白表达的小分子B21

进一步研究发现 B21 的丙烯酰胺和丙烯酰胺类似物不影响 22Rv1 细胞的 AR 转录物含量，表明 α-氯乙酰胺基团是 B21 化合物发挥活性的重要基团，同时也鉴定出效力更强的化合物 (R)-SKBG-1，而其对映体化合物 (S)-SKBG-1 不具有抑制 AR 转录的作用，揭示了对映体化合物对 AR 转录抑制具有严格的结构活性关系。

表格1. α-氯乙酰胺化合物B21及其类似物
B21 类似化合物与 NONO 的 C145 共价结合

接下来，作者通过化学蛋白质组学来鉴定活性化合物 B21 及其类似物的蛋白质靶点。发现 RBP 蛋白 NONO 第 145 位半胱氨酸基本上被所有活性化合物所激活，NONO (或 p54NRB) 是 RNA 和 DNA 结合蛋白（DBHS）家族的成员，该家族还包括同源蛋白 PSPC1 和 SFPQ（或 PSF）。NONO 与 PSPC1 和 SFPQ 有 40-50%的序列同源性，但 C145 是 NONO 所特有的，表明活性化合物 B21 以及类似物选择性地与 DBHS 蛋白中的 NONO 结合。NONO– PSPC1 异源二聚体的晶体结构进一步揭示了 C145 位于 NONO 的两个 RNA 识别基序 (RRMs) 之间的铰链区域，显示该位点残基对 RNA 结合至关重要。

图b. 活性分子与靶蛋白NONO C145位结合
B21 类似物(R)-SKBG-1 对细胞转录组以及蛋白组作用

DBHS 蛋白作为异二聚体和同源二聚体参与基因调控的不同步骤，包括 DNA 解旋和转录以及 mRNA 剪接、运输和质量控制。转录组学分析发现 (R)-SKBG-1 处理显著降低细胞 mRNA 水平，而非活性的 (S)-SKBG-1 处理则没有明显作用。同时，作者发现敲除 NONO 消除了 (R)-SKBG-1 对 mRNA 的作用，表明 (R)-SKBG-1 通过 NONO 调控 mRNA 转录。

同时，蛋白质组学分析发现 (R)-SKBG-1 处理除了下调 AR 表达之外，还包含其它的致癌转录因子，如乳腺癌依赖性蛋白 TRPS1 和 Wnt - β-catenin 通路组分 AFF3，以及 cgcg 基序结合转录激活因子 BANP37 和组蛋白去甲基化酶 KDM4B38。这些结果强调了 NONO 配体分子(R)-SKBG-1 在癌细胞中重塑基因表达网络的潜力，(R)-SKBG-1 抑制细胞生长可能与此相关，(R)-SKBG-1 发挥功能又依赖于 NONO 的存在。

图c. (R)- SKBG -1下调细胞转录组和蛋白质组
B21 类化合物稳定细胞内NONO-mRNA 的相互作用

之前的研究表明，DBHS 家族蛋白在核旁斑和核仁周围小体之间持续穿梭，并且 NONO 在细胞核 paraspeckles 小体中发挥作用，paraspeckles 小体是由 DBHS 蛋白与长链非编码 RNAs43 结合形成的相分离的亚核透明小体，被认为通过特异性 mRNAs44 的核滞留来调节基因表达。免疫荧光研究表明，活性化合物(R)-SKBG 诱导 NONO 形成了大的亚核焦点， 这些聚集焦点在核仁标记物原纤维素附近。这表明(R)-SKBG-1 可能会破坏 NONO 正常的动态运输，从而导致 NONO 在核仁周围小体中积累。

对 (R)-SKBG-1 处理的 22Rv1 细胞中进行了 NONO eCLIP-seq 实验，发现 NONO- RNA 相互 大多数发生在近端和远端内含子区域。这些数据表明，(R)-SKBG-1 增强但没有实质上改变 NONO 与 RNA 结合的序列偏好。同时，(R)-SKBG-1 通过增强与 RNA 的第一个外显子和第一个内含子的 5 '末端的相互作用来影响 NONO 在这些转录本中的位置偏好。

图d. (R)- SKBG -1诱导NONO-mRNA在核仁周围富集
总结

综上所述，Benjamin F. Cravatt 团队发现了一种降解 AR 的小分子 B21 及其类似物，这种化学活性分子通过共价结合 NONO，并诱导 NONO 在细胞核焦点和未成熟转录本 RNA的5 ' 末端的积累，从而重塑癌细胞的转录组和蛋白质组。PSPC1 和 SFPQ 的升高无法补偿 NONO 功能的改变，因为共价结合 (R)-SKBG-1 的 NONO 仍然与 RNA 结合，最终导致它们的加工和降解受损。这些化合物以 NONO 依赖的方式调节富集于 RNA 稳态和信号转导的基因网络的表达， 以及癌细胞的生长。

图e. (R)- SKBG -1重塑基因表达网路模式图

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原文出处：

[1]Kathman SG, Koo SJ, Lindsey GL, et al. Remodeling oncogenic transcriptomes by small molecules targeting NONO [published online ahead of print, 2023 Mar 2]. Nat Chem Biol. 2023;10.1038/s41589-023-01270-0. doi:10.1038/s41589-023-01270-0

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