薄层鉴别结果判断

huanhuanaw

各位老师，我想请教一下，薄层鉴别样品和对照在同一位置这个怎么判定是不是同一位置，位置允许差多少

amnmn

计算Rf值，在±5%以内

huanhuanaw

amnmn 发表于 2023-5-15 08:16
计算Rf值，在±5%以内

请问这是哪里规定的

123升水

huanhuanaw 发表于 2023-5-16 12:39
请问这是哪里规定的

药典0502薄层色谱法

123升水

0502 薄层色谱法
　　薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
　　1.仪器与材料
　　（1）薄层板  按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。固定相中可加入黏合剂、荧光剂。硅胶薄层板常用的有硅胶 G、硅胶 GF254、硅胶 H、硅胶 HF254，G、H 表示含或不含石膏黏合剂，F254 为在紫外光 254nm 波长下显绿色背景的荧光剂。按固定相粒径大小分为普通薄层板（10~40µm）和高效薄层板（5~10µm）。
　　在保证色谱质量的前提下，可对薄层板进行特别处理和化学改性以适应分离的要求，可用实验室自制的薄层板。固定相颗粒大小一般要求粒径为 10~40μm。玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
　　（2）点样器  一般釆用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
　　（3）展开容器  上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开用专用的水平展开槽。
　　（4）显色装置  喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
　　（5）检视装置  为装有可见光、254nm 及 365nm 紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。暗箱内光源应有足够的光照度。
　　（6）薄层色谱扫描仪  系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。
　　2.操作方法
　　（1）薄层板制备
　　市售薄层板  临用前一般应在 110℃ 活化 30 分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板、塑料薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的固定相层不得有破损。如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，晾干，110℃ 活化，置干燥器中备用。
　　自制薄层板  除另有规定外，将 1 份固定相和 3 份水（或加有黏合剂的水溶液，如 0.2%~0.5%羟甲基纤维素钠水溶液，或为规定浓度的改性剂溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为 0.2~0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在 110℃ 烘 30 分钟，随即置于有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，并且无麻点、无气泡、无破损及污染。
　　（2）点样  除另有规定外，在洁净干燥的环境中，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上。一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边 10~15mm，高效板一般基线离底边 8~10mm。圆点状直径一般不大于 4mm，高效板一般不大于 2mm。接触点样时注意勿损伤薄层表面。条带状宽度一般为 5~10mm，高效板条带宽度一般为 4~8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于 8mm，高效板供试品间隔不少于 5mm。
　　（3）展开  将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点 5mm 为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开 8~15cm，高效薄层板上行展开 5~8cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。
　　展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持 15~30 分钟。溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内壁贴与展开缸高、宽同样大小的滤纸，一端浸入展开剂中，密闭一定时间，使溶剂蒸气达到饱和再如法展开。
　　必要时，可进行二次展开或双向展开，进行第二次展开前，应使薄层板残留的展开剂完全挥干。
　　（4）显色与检视  有颜色的物质可在可见光下直接检视，无色物质可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在可见光下检视。有荧光的物质或显色后可激发产生荧光的物质可在紫外光灯（365nm 或 254nm）下观察荧光斑点。对于在紫外光下有吸收的成分，可用带有荧光剂的薄层板（如硅胶 GF254 板），在紫外光灯（254nm）下观察荧光板面上的荧光物质淬灭形成的斑点。
　　（5）记录  薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层色谱扫描仪扫描或其他适宜的方式记录相应的色谱图。
　　3.系统适用性试验
　　按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和标准物质对实验条件进行试验和调整，应符合规定的要求。
　　（1）比移值（Rf）  系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。
　　
　　除另有规定外，杂质检查时，各杂质斑点的比移值 Rf 以在 0.2~0.8 之间为宜。
　　（2）检出限  系指限量检查或杂质检查时，供试品溶液中被测物质能被检出的最低浓度或量。一般采用已知浓度的供试品溶液或对照标准溶液，与稀释若干倍的自身对照标准溶液在规定的色谱条件下，在同一薄层板上点样、展开、检视，后者显清晰可辨斑点的浓度或量作为检出限。
　　（3）分离度（或称分离效能）  鉴别时，供试品与标准物质色谱中的斑点均应清晰分离。当薄层色谱扫描法用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度(R)的计算公式为：
　　R=2(d2-d1)/(W1+W2)
　　式中 d2 为相邻两峰中后一峰与原点的距离；
　　d1 为相邻两峰中前一峰与原点的距离；
　　W1 及 W2 为相邻两峰各自的峰宽。
　　除另有规定外，分离度应大于 1.0。
　　在化学药品杂质检查的方法选择时，可将杂质对照品用供试品自身稀释的对照溶液溶解制成混合对照溶液，也可将杂质对照品用待测组分的对照品溶液溶解制成混合对照标准溶液，还可釆用供试品以适当的降解方法获得的溶液，上述溶液点样展开后的色谱图中，应显示清晰分离的斑点。
　　（4）相对标准偏差  薄层扫描含量测定时，同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 5.0%；需显色后测定的或者异板的相对标准偏差应不大于 10.0%。
　　4.测定法
　　（1）鉴别  按各品种项下规定的方法，制备供试品溶液和对照标准溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品色谱图中所显斑点的位置和颜色（或荧光）应与标准物质色谱图的斑点一致。必要时化学药品可采用供试品溶液与标准溶液混合点样、展开，与标准物质相应斑点应为单一、紧密斑点。
　　（2）限量检查与杂质检查  按各品种项下规定的方法，制备供试品溶液和对照标准溶液，并按规定的色谱条件点样、展开和检视。供试品溶液色谱图中待检查的斑点与相应的标准物质斑点比较，颜色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，测定峰面积值，供试品色谱图中相应斑点的峰面积值不得大于标准物质的峰面积值。含量限度检查应按规定测定限量。
　　化学药品杂质检查可釆用杂质对照法、供试品溶液的自身稀释对照法或两法并用。供试品溶液除主斑点外的其他斑点与相应的杂质对照标准溶液或系列浓度杂质对照标准溶液的相应主斑点比较，不得更深，或与供试品溶液自身稀释对照溶液或系列浓度自身稀释对照溶液的相应主斑点比较，不得更深。通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量，当釆用系列自身稀释对照溶液时，也可规定估计的杂质总量。
　　（3）含量测定  照薄层色谱扫描法，按各品种项下规定的方法，制备供试品溶液和对照标准溶液，并按规定的色谱条件点样、展开、扫描测定。或将待测色谱斑点刮下经洗脱后，再用适宜的方法测定。
　　5.薄层色谱扫描法
　　系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。可根据不同薄层色谱扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。除另有规定外，含量测定应使用市售薄层板。
　　扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱图中待测斑点的比移值（Rf 值）、光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收和最小吸收应与对照标准溶液相符，以保证测定结果的准确性。薄层色谱扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与标准物质同板点样、展开、扫描、测定和计算。
　　薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采用线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可用多点法校正多项式回归计算。供试品溶液和对照标准溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不得少于 2 个，标准物质每一浓度不得少于 2 个。扫描时，应沿展开方向扫描，不可横向扫描。

huanhuanaw

123升水 发表于 2023-5-29 16:35
0502 薄层色谱法
　　薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成 ...

药典没规定样品和对照比移值的比例  ±5%是在哪里规定的

稽srswqrbn

很详细，有学习到

123升水

huanhuanaw 发表于 2023-5-30 17:21
药典没规定样品和对照比移值的比例  ±5%是在哪里规定的

不清楚，正常情况点在同一个位置

肖月公

详细，有学习到

yaoaihui

0502 薄层色谱法里面也没说RF相差多少可以认为一致，我反复看了都没有

yaoaihui

“一致”并不意味着两个Rf值必须完全相等，而是指它们在实验误差允许范围内没有显著差异。判断依据是一个综合性的“系统适用性”要求，主要包括以下几点：

Rf值的相对接近：这是您问题的核心。虽然没有绝对标准，但业界普遍接受的经验法则是相差不超过 ±0.02。在某些要求更严格或系统稳定性非常好的情况下，这个范围可以缩小到 ±0.01。

斑点的视觉外观：这是至关重要的一环。即使Rf值非常接近，判断时还必须考虑：

斑点形状：是否都是圆形、椭圆形，且边缘清晰。

斑点大小：大小是否相近。

斑点颜色和强度：在显色后或紫外灯下，颜色和深浅是否一致。

使用对照品共薄层：最可靠的方法是将供试品溶液和对照品（标准）溶液在同一块薄层板上点样、展开和检测。这样可以消除板与板之间、当天环境条件（温度、湿度）带来的微小变异，使比较更具说服力。

系统适用性要求：许多药典方法会在正文中明确要求，对照品溶液主斑点应呈现单一、清晰的斑点，或者要求特定物质对的分离度要达到某个标准。这间接保证了Rf值的可比性。

总结：您不能只看两个Rf值的数字差。必须结合上述所有因素进行综合判断。±0.02是一个常用的、合理的参考阈值，但最终判定需以法规中规定的“一致”原则和系统适用性为准。

相关法规和指导原则
以下法规和指导原则都强调了“一致”的概念，但通常不会给出一个具体的数字差值，而是描述性的要求。

1. 中国药典 (ChP)
这是国内最直接相关的法规。

《中国药典》2020年版 通则 0502 薄层色谱法

在【鉴别】项下规定：“供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置应与对照品溶液的主斑点一致”。

在【检查】项下规定：“供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，或与供试品溶液自身稀释对照溶液的主斑点比较，其颜色（或荧光）不得更深”。

关键点：药典强调的是“位置一致”，这是一个定性描述，其具体接受标准依赖于成熟的实验室规范和系统适用性。它没有给出具体的Rf差值。

2. 美国药典 (USP)
美国药典是国际公认的权威标准之一。

USP General Chapter 〈621〉 Chromatography

虽然〈621〉主要针对液相色谱和气相色谱，但其关于色谱系统适用性的基本原则也适用于TLC。它强调方法的验证和系统适用性测试。

USP 各论

在具体的药品各论中，会描述TLC鉴别方法。例如，会这样描述：“The principal spot from the Test solution corresponds in color, size, and Rf value to that from the Standard solution.”（供试品溶液的主斑点在颜色、大小和Rf值上与标准品溶液的主斑点相对应）。

关键点：USP同样使用了“corresponds”（对应）这个定性词汇，并将Rf值与颜色、大小并列作为判断依据。

3. 欧洲药典 (Ph. Eur.)
欧洲药典与中国药典类似。

European Pharmacopoeia General Chapter 2.2.27. Thin-layer chromatography

其表述与ChP高度相似：“The principal spot in the chromatogram obtained with the test solution is similar in position, colour and size to the spot in the chromatogram obtained with the reference solution.”（供试品溶液色谱图中的主斑点与对照品溶液色谱图中的斑点在位置、颜色和大小上相似）。

关键点：再次使用了“similar”（相似）这一定性描述。

4. 人用药品注册技术要求国际协调会 (ICH)
ICH指南虽然不直接规定TLC的Rf差值，但它为分析方法的确立提供了顶层框架。

ICH Q2(R1) Validation of Analytical Procedures

该指南规定了分析方法验证的参数，如专属性（Specificity） 和鉴别能力（Identification）。

一个TLC鉴别方法必须经过验证，证明其能够明确区分目标化合物与其他可能存在的化合物。这就隐含了要求供试品与对照品的斑点位置（Rf）必须在特定的实验条件下具有高度重现性和可比性。

结论与建议
没有绝对数值：全球主要药典（ChP, USP, Ph.Eur.）均未规定两个Rf值之间具体的数字差异。它们使用的是“一致”、“对应”或“相似”等定性术语。

依赖经验和系统适用性：具体的、可操作的接受标准（如Rf差值±0.02）是建立在实验室内部方法验证和长期实践经验基础上的。您所在实验室的标准操作规程中，应该对这个可接受范围有明确的规定。

综合判断：始终记住，判断“一致”是一个综合过程：

Rf值接近（参考经验值 ±0.02）。

斑点外观（颜色、形状、大小）高度相似。

最好在同一板上进行对比。

给您的实际操作建议：
在您的方法验证或日常检验中，可以将Rf差值 ±0.02 作为内部接受标准写入SOP。同时，必须附上斑点的图像证据，并记录下斑点外观的描述。如果遇到Rf差值略大于0.02（例如0.03），但斑点外观完全一致，且系统适用性测试（如对照品平行样之间的Rf重现性）良好，则仍可判定为“一致”，但需要在记录中备注并说明理由。