小奕说药 | 灌流工艺助力双特异性抗体质量提升

奕安济世生物药

在生物制药领域，双特异性抗体因其独特的"双靶点协同作用机制"已成为肿瘤免疫治疗的新一代利器。然而，这类复杂结构的药物在工艺开发中面临严峻挑战——行业研究显示，越来越多的双抗临床失败案例与产品质量缺陷直接相关。特别是抗体聚集引发的免疫原性风险、糖基化异质性导致的药效波动、电荷变异体对药代动力学的影响，以及片段化造成的结构完整性破坏，共同构成了工艺开发的"四大质量壁垒"。

传统批次补料工艺（Fed-batch）由于营养梯度波动和代谢废物累积，往往难以维持稳定的细胞微环境，同时影响产品质量。而灌流工艺（Perfusion）通过细胞截留装置实现培养基持续更新，不仅将细胞活率维持在95%以上，更创造了近似生理状态的培养条件。这种动态平衡特性，使其在提升抗体关键质量属性（CQAs）方面表现出显著优势。

1.显著降低双抗聚集

Amgen公司的Gomez等人在2019年的一项研究中发现，CHO细胞采用批次补料工艺生产重组双特异性支架蛋白X（Protein X），聚集体高达62%，且该聚集体会随着反应器内蛋白质浓度的积累而增加【1】。而采用灌流工艺生产时，Protein X单体产量提高了4-5倍，且单体含量从平均44%提高至70%，聚集体含量降低至30%左右（表1）。

表1. 灌流工艺显著降低双特异性蛋白X的聚集体比例

FB：Fed-batch, low peak VCD. INT: Intensified, high VCD. PER1: Perfusion VCD 1. PER2: Perfusion VCD 2. PER3: Perfusion VCD 3. PER4: Perfusion VCD 4.

该团队在2020年进一步比较了批次补料工艺和灌流工艺对6种细胞株和3种双特异性重组支架蛋白的影响。结果表明，与批次补料工艺相比，强化灌流工艺聚集体平均减少22%，最多减少72%（图1），此外，平均累计活细胞密度（IVCD）和总产量增加约15倍，单日单位体积产率提高约5倍【2】。

图1. 批次补料和灌流工艺所产蛋白的聚集体水平比较

此外，Sinharoy等人在2020年深入分析了灌流工艺降低双抗聚集水平的胞内机理。结果表明，培养过程中细胞内外环境的变化作用于线粒体功能完整性、氧化还原稳态和内质网应激，最终影响产物聚集体的形成（图 3）。采用灌流工艺替代批次补料工艺，则能为细胞生长和维持提供更有利的胞内外环境，从而延缓线粒体功能衰退、维持胞内氧化还原平衡和缓解内质网应激，最终有效降低双抗聚集水平【3】。

图2. 双抗聚集的胞内机制示意图

奕安济世上游工艺开发团队也比较了批次补料工艺和灌流工艺对双特异性抗体聚集的影响。结果显示，与批次补料工艺相比，在3个不同克隆中，灌流工艺聚集体减少了16% - 52%（图3）。这也验证了Sinharoy 提出的灌流工艺降低双抗聚集水平的胞内机理。

图3. 批次补料和灌流工艺所产双抗的聚集体水平比较

2.调控糖基化修饰

灌流工艺通过细胞截留装置实现培养基连续更新，维持稳定的营养环境，避免代谢副产物（如乳酸）积累，为糖基化酶促反应提供理想条件。默克公司的Bielser等人在2019年比较了批次补料工艺和灌流工艺对共轭重组融合蛋白的影响【4】。结果发现，与批次补料工艺一样，灌流工艺也会影响糖基化的分布（图4 A-D）。在灌流达到稳态阶段的早期，糖基化还是会出现波动，第14天之后才趋于稳定（图4 E-F），这可能是达到稳态时工艺参数的变化导致的。

图4. 三种培养模式下的糖基化比较

PF: Perfusion，LS: Low seeding fed-batch，HS: High seeding fed-batch

从图4-A中可以看出，灌流工艺的高甘露糖型要高于批次补料工艺，虽都低于10%可接受范围，但高甘露糖型在药物疗效（ADCC活性）、药代动力学、药物稳定性、脱靶毒性等方面有着重要影响，当然是比例越低越好。奕安济世团队采用灌流工艺对两种双抗分子的高甘露糖型进行优化，发现相比于批次补料工艺，灌流工艺的高甘露糖型比例都有很大程度的降低。

图5. 批次补料和灌流工艺所产双抗的高甘露糖比例比较

3.改善电荷异质性

默克Bielser等人的研究发现在灌流细胞培养中电荷异构体分布更均一。主峰明显升高，在14天的稳态灌流中也更稳定，而两种批次补料工艺的主峰随着培养时间逐渐降低，酸性峰和碱性峰逐渐增加（图6）【4】。

图6. 三种培养模式下的电荷异构体水平比较

Amgen公司的Gomez等人也对比了批次补料工艺和灌流工艺对3种双特异性重组支架蛋白电荷异构体的影响，结果发现，3种蛋白的酸性峰在灌流工艺中都有显著的降低，分子A降低76%，分子D降低49%，分子F降低23%【2】。

图7. 批次补料和灌流工艺所产蛋白的电荷异构体水平比较

奕安济世团队在双抗分子B上也发现灌流工艺的酸性峰和碱性峰要低于批次补料工艺，主峰要明显高于批次补料工艺。

图8. 批次补料和灌流工艺所产双抗的电荷异构体水平比较

总之，灌流工艺可有效改善电荷异构体分布，推测可能原因有：乳酸和氨等代谢废物被及时移除，减少了脱酰胺等修饰；产物在生物反应器中的停留时间更短；高细胞密度下的稳态培养减少了营养匮乏或毒性环境，改善蛋白合成一致性，使电荷修饰更可控，提升主成分比例；可通过细胞特异性灌流速率（Cell specific perfusion rate，CSPR）按需补充培养基，从而减少治疗性蛋白质与细胞培养基内化学物质之间的相互作用等【5】。

4.抑制抗体片段化

默克Bielser等人的研究还发现在灌流细胞培养中蛋白片段化更低，两种批次补料工艺的片段化随着培养时间逐渐增加，并显著高于灌流工艺（图8）【4】。Amgen公司的Gomez等人也发现相比于批次补料工艺，3种双特异性重组支架蛋白（D、E、F）在灌流工艺中的片段化分别下降了66%、43%和75%（图10）【2】。

图9. 三种培养模式下的片段化水平比较

图10. 批次补料和灌流工艺所产蛋白的片段化水平比较

灌流工艺抑制抗体片段化的核心原理在于通过连续培养基更新和细胞状态优化，降低蛋白水解酶活性及减少抗体暴露于降解环境的时间。相较于批次补料工艺，其在减少片段化杂质方面可提升效率达58%以上【6】，为复杂抗体药物（尤其是双抗）的质量控制提供关键保障。

结语

灌流工艺作为生物制药领域的技术革新，已展现出突破双特异性抗体"四大质量壁垒"的卓越能力。通过持续优化细胞微环境，该工艺不仅将聚集体降低达72%、高甘露糖型比例显著优化，更使电荷异质性分布明显改善，并将片段化杂质减少58%以上。这些突破性进展为双抗药物的临床转化提供了关键质量保障，同时也揭示了工艺创新与产品质量的深层关联——当培养系统更贴近生理稳态时，细胞便能以更高保真度完成复杂蛋白的合成。未来，随着灌流工艺与过程分析技术（PAT）、人工智能控制的深度融合，双特异性抗体有望实现从"可生产"到"优生产"的跨越，为肿瘤免疫治疗带来更安全有效的生物制剂。这一进程也将为其他复杂结构生物药的工艺开发树立新范式。

参考文献

【1】 Gomez N, et al., Perfusion CHO cell culture applied to lower aggregation and increase volumetric productivity for a bispecific recombinant protein. J Biotechnol. 2019; 304:70-77.

【2】Gomez N, et al., Improving product quality and productivity of bispecific molecules through the application of continuous perfusion principles. Biotechnol Prog. 2020; 36(4):e2973.

【3】Sinharoy P, et al., Perfusion reduces bispecific antibody aggregation via mitigating mitochondrial dysfunction-induced glutathione oxidation and ER stress in CHO cells. Sci Rep. 2020; 10(1):16620.

【4】Bielser JM, et al., Perfusion cell culture for the production of conjugated recombinant fusion proteins reduces clipping and quality heterogeneity compared to batch-mode processes. J Biotechnol. 2019; 302:26-31.

【5】Chung S, et al., Industrial bioprocessing perspectives on managing therapeutic protein charge variant profiles. Biotechnol Bioeng. 2018; 115(7):1646-1665.

【6】Qin Y, et al., Productivity and quality improvement for a symmetric bispecific antibody through the application of intensified perfusion cell culture. Antib Ther. 2022; 5(2):111-120.

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xqliu

学习了，谢谢提供分享。

奕安济世生物药

xqliu 发表于 2025-6-25 06:50
学习了，谢谢提供分享。