链霉亲和素磁珠的FAQ

EPRUI

:每个链霉亲和素分子上有多少个生物素结合位点?

A:链霉亲和素是一种由四个亚基组成的蛋白，每个亚基包含一个针对生物素的高亲和力结合位点(Ko=10-15M)。链霉亲和素的生物素结合性能与亲和素(avidin)相同，但它的等电点更低(pl =5)并且不含糖基，因此具有更低的非特异性结合。

Q:哪些缓冲液适合用于将生物素化分子与链霉亲和素磁珠结合?

A:对于生物素化蛋白以及大部分生物素化分子，PBS是首选。如需结合生物素化的核酸分子，我们推荐以下缓冲液用于结合与洗涤(B&W):10.0 mM Tris-HCI (pH 7.5)+1.0 mM EDTA+2.0 M NaCl。

Q:如何对链霉亲和素磁珠上结合的生物素化分子进行测定?

A:要测定链霉亲和素磁珠上结合生物素化分子的量，需要对上清液中未结合的分子进行定量。对于核酸分子可以使用OD值或者定量凝胶电泳。对于蛋白分子可以使用BCA法之类的蛋白定量检测方法。此外也可以对分子进行放射性同位素或者荧光标记，然后检测磁珠上结合的分子或者上清液中未结合的分子的信号值。

Q:链霉亲和素磁珠能否直接用于PCR实验中?

A:少量的磁珠不会对PCR体系产生抑制作用。但各个PCR体系对于磁珠浓度耐受的上限需要通过实验进行验证。

Q:当磁珠表面结合了生物素化的双链DNA时，如何将非生物素化的一条单链从上面解离下来?

A:有两种方法可以解离非生物素化的单链。方法中试剂的用量基于20 μL的链霉亲和素磁珠用量。每种方法都会使得极少量的生物素化单链从磁珠表面解离。如果需要完全没有解离的结果可以考虑使用带有两个生物素的序列或者将氨基末端的序列偶联到羧基磁珠上。

1)加热法

·用50μL1xSSC缓冲液*洗涤磁珠。

·将磁珠重悬于另一50 μL1xSSC缓冲液中。在95℃孵育5分钟。

·将磁珠置于磁力架上吸附1-2分钟。将上清液移到另一个管子里。

·非生物素化的单链在上清液中。

2)碱洗法

·用50μL1xSSC缓冲液*洗涤磁珠。

·将磁珠重悬于20μL的新鲜配制的0.15 M NaOH溶液中。

·在室温下孵育10分钟。将磁珠置于磁力架上吸附1-2分钟。将上清液移到另一个管子里。

·非生物素化的单链在上清液中。将其中加入2.2 μL的10xTE,pH7.5和1.3μL的1.25 M醋酸溶液将pH调至中性。解离完成后，用50 μL的0.1M NaOH溶液、50μL的B&W缓冲液和50μL的TE缓冲液各洗涤磁珠一次。

*1x SSC缓冲液的配制：缓冲液含有0.15 M NaCl,0.015 M柠檬酸钠。将盐溶解于800 mL的水中，用NaOH溶液调节pH至7.0,然后加水到总体积1 L。

Q:如何从链霉亲和素磁珠上解离生物素化分子?

A:链霉亲和素-生物素相互作用是已知的非键合蛋白分子相互作用力当中最强的一个。二者之间的结合非常迅速，结合一旦形成，几乎不受外界因素(包括很宽的pH范围、温度范围、有机溶剂以及各种蛋白变性剂)的影响。除非使用一些特殊的变种生物素或者链霉亲和素蛋白，使得二者之间的亲和力降低，能够用比较温和的条件解离二者，否则只有非常苛刻的条件才能将生物素化分子从链霉亲和素磁珠表面解离。以下给出两个示例。

1)解离生物素化核酸分子

将结合了生物素化核酸分子的链霉亲和素磁珠在在95%的甲酰胺+10mM的EDTA,pH 8.2中于65℃下孵育5分钟或者于90℃下孵育2分钟。用磁吸分离磁珠，上清液中包含了解离下来的核酸分子。

2)解离生物素化蛋白

将结合了生物素化蛋白的链霉亲和素磁珠在0.1%SDS或者SDS-PAGE缓冲液中煮沸3分钟。

Q:链霉亲和素磁珠能否重复使用?

A:对于大部分需要解离生物素化分子的实验，磁珠不能重复使用。由于链霉亲和素-生物素的相互作用过强，解离条件往往会破坏链霉亲和素分子。不过，如果磁珠是用于DNA-蛋白共沉淀之类实验，只需温和的条件即可将DNA与蛋白解离开来的话，磁珠可以重复使用。

Q:如果我要在免疫沉淀实验后将蛋白从链霉亲和素磁珠洗脱而不洗脱磁珠上结合的生物素化抗体，应当用何种条件?

A:可以使用较为温和的洗脱条件，例如高盐(>1M)的缓冲

液或者低pH的缓冲液。像0.1M甘氨酸，pH 2.5-3.0这种洗脱液可以用于解离大多数的抗原-抗体复合物。

Q:将链霉亲和素磁珠不加生物素化捕获分子而直接与样本混合用作阴性对照组的时候，产生了大量的非特异性吸附，这是为什么?

A:在含有各种不同种类分子的样本中，任何固相载体(包括磁珠)都能通过一系列相互作用吸附这些分子。相互作用的种类包含疏水相互作用、静电相互作用以及其他种类的相互作用。这些相互作用带来非特异性吸附并不令人惊异。综上，将磁珠直接加入样本中通常用于对样本的预清洁(去除可能产生非特异性吸附的分子)。这并不是一个好的阴性对照实验条件。当磁珠表面偶联了特异性捕获分子而后进行封闭之后，其非特异性吸附相比于未偶联的磁珠会明显地降低。如果要做阴性对照的话，可以尝试用磁珠偶联一个结构类似但是不会与目标分子产生特异性结合的捕获分子。

Q:链霉亲和素分子是否会从磁珠表面脱落?

A:链霉亲和素分子是共价偶联到磁珠表面的。不过并不是所有的四个亚基都共价偶联在磁珠上，一般只有1-2个亚基是与磁珠表面形成共价键的。像很多具有高级结构的蛋白一样，当链霉亲和素受热的时候，它也会发生变性，亚基会互相解离。如果链霉亲和素磁珠被加热至沸腾温度，部分的链霉亲和素蛋白亚基会从磁珠表面以游离亚基或者亚基聚集体的形式脱落，但共价偶联上去的那部分亚基不会脱落。当链霉亲和素与生物素结合时，这个复合物实际上比链霉亲和素蛋白本身(亚基之间的结合)还要稳定。在常规的使用条件下，链霉亲和素从磁珠表面的脱落是可以忽略不计的(37℃下2个月，从磁珠表面脱落的链霉亲和素不超过总量的0.2%)。

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xqliu

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