枯草芽孢杆菌

凯rq8rec5y

做样品洗脱方法回收率试验时，枯草芽孢杆菌用薄膜过滤法过滤后在TSA上培养，结果都没有长菌，是什么原因呢，阴性对照也没有长，然后黑曲霉用相同的方法过滤后在SDA上培养能正常长菌

具体的试验流程如下：

（1）菌液制备：枯草芽孢杆菌浓度为0.5~1.0×103cfu/ml，稀释10倍待用。

（2）样品处理：取菌液1ml，均匀涂抹于制备好的样品上。

（3）样品洗脱：取出处理后的样品，放入装有100ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的灭菌瓶中，即得第一次洗脱液。同法洗脱第二次、第三次、第四次。采用薄膜过滤法，每张滤膜过滤适量供试液，用适量PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于培养基上，每个样品接种于胰酪大豆胨琼脂培养基；

世间始终你好

你描述的问题是：枯草芽孢杆菌在样品洗脱-薄膜过滤后贴在TSA培养基上培养无菌生长，而黑曲霉在SDA上可以正常生长。结合流程细节分析，以下是可能原因及建议排查方向：

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一、实验流程本身是否存在问题1. 薄膜材质或处理方式问题

• 有些**滤膜（如某些醋酸纤维素、尼龙膜）**可能对细菌不友好，具有杀菌作用或抑菌残留。
  
• 黑曲霉（真菌）对环境应激耐受强一些，能生长，不代表细菌也能。
  
  

建议：

• 更换滤膜品牌/材质试试（推荐混合纤维素酯膜，0.45 μm）。
  
• 检查滤膜是否有厂家预处理（如含有湿润剂、防腐剂）。
  
  

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2. 冲洗液或洗脱液问题

• 使用的氯化钠-蛋白胨缓冲液如果灭菌方式不当（如高压灭菌时间过长或pH变化），可能影响细菌存活。
  
• 蛋白胨缓冲液pH 7.0易受灭菌影响而降解或变酸。
  
  

建议：

• pH 复测确认是否仍为7.0，建议现配现用。
  
• 与未经过洗脱液处理的菌液做正对照（如直接滴加菌液到TSA）。
  
  

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3. 培养条件是否适合细菌复苏

• 枯草芽孢杆菌可能以芽孢形式存在，需要适合的温度和时间复苏（如37℃培养48小时）。
  
• TSA培养时间或温度不足可能导致“看起来没长”。
  
  

建议：

• 提高培养时间至48小时，必要时增加CO₂（一般不需要）。
  
• 可以先做培养基生长能力确认试验：直接将稀释后的菌液滴加到 TSA 培养基表面培养，确认培养基没问题。
  
  

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二、对照组未长菌——说明问题更偏向“整体操作或滤膜相关”你说阴性对照也未长菌，这可能意味着：
1. 操作中存在杀菌因素

• 如滤膜残留杀菌成分、使用器具有酒精或灭菌残留。
  
• 抑菌残留最常见来源：滤膜本身、镊子残留乙醇未干、冲洗液灭菌不彻底或降解产物毒性。
  
  

2. 培养基未被污染但也不支持生长

• 这与培养基保存、干燥过度、倒皿时温度过高有关。
  
  

建议：

• 同批培养基上点种标准菌株对照验证。
  
• 检查洗脱液、滤膜、镊子是否带杀菌残留（酒精未挥发干燥）。
  
• 设一个正对照组：同样稀释菌液直接过滤，不经过样品洗脱，确认是否在洗脱过程中导致灭活。
  
  

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推荐你做以下几个排查对照实验：组别操作流程用途
A（阳性对照）菌液稀释后直接滴加至TSA检查菌株活性及培养基
B（阳性对照2）菌液稀释后直接薄膜过滤→TSA培养检查滤膜/操作流程
C（洗脱组）涂布→洗脱→薄膜过滤→培养实验本身的组
D（阴性对照）不加菌→洗脱→过滤→培养判断背景污染

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总结可能问题关键词：

• 滤膜材质或灭菌方法残留毒性（最常见）
  
• 洗脱液降解或灭活菌体
  
• 培养基质量或培养条件不当
  
• 镊子等器具残留酒精
  
  

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Gigiocy

买的定量菌株吗？验收的时候有没有做确认？可以直接涂布一下TSA，看看能不能长出来，排除一下菌和培养基的问题。如果没问题就考虑下样品是否存在抑菌或杀菌的情况

凯rq8rec5y

Gigiocy 发表于 2025-8-4 12:08
买的定量菌株吗？验收的时候有没有做确认？可以直接涂布一下TSA，看看能不能长出来，排除一下菌和培养基的 ...

是定量菌株，没有确认过

Gigiocy

凯rq8rec5y 发表于 2025-8-4 12:44
是定量菌株，没有确认过

那你可以去排除下看看是什么情况

18913555243

每毫升的菌落太少了。

凯rq8rec5y

18913555243 发表于 2025-8-4 13:38
每毫升的菌落太少了。

是样品染菌的菌量要多一点嘛

凯rq8rec5y

Gigiocy 发表于 2025-8-4 13:36
那你可以去排除下看看是什么情况

嗯嗯好的，谢谢啦

凯rq8rec5y

铜绿假单胞菌长成一片是因为菌株没有分散开来吗

18913555243

凯rq8rec5y 发表于 2025-8-4 13:42
是样品染菌的菌量要多一点嘛

理论上是只要有一个菌都能长，但是要是菌种活力不足，就不容易长。

八档丶电风扇

枯草不长也有可能是你涂布在样品到你过滤贴膜的时间太长了，时间过长会导致菌液死亡，而且你本来菌浓度就不高；

18913555243

凯rq8rec5y 发表于 2025-8-4 15:23
铜绿假单胞菌长成一片是因为菌株没有分散开来吗

基本上是这样的。加菌前，菌液不均匀。

八档丶电风扇

凯rq8rec5y 发表于 2025-8-4 15:23
铜绿假单胞菌长成一片是因为菌株没有分散开来吗

铜绿过滤的时候要尽量抽干一点，不然很容易蔓延，菌浓度也不要太高，尽量在50cfu/每膜以下

凯rq8rec5y

八档丶电风扇 发表于 2025-8-4 16:46
铜绿过滤的时候要尽量抽干一点，不然很容易蔓延，菌浓度也不要太高，尽量在50cfu/每膜以下

好的感谢感谢

凯rq8rec5y

18913555243 发表于 2025-8-4 16:44
理论上是只要有一个菌都能长，但是要是菌种活力不足，就不容易长。

好的，非常感谢

danhuang258

从楼主的表述来看，也有可能是膜的问题，建议做下不同厂家的滤膜测试

不见猫骨头

上一家公司是做定量菌株的，枯草芽孢杆菌除非做成孢子的形式，不要定量菌株里面的枯草芽孢杆菌活性很差很差，一个星期不到，基本上就没有了

为了微生物

世间始终你好 发表于 2025-8-4 11:17
你描述的问题是：枯草芽孢杆菌在样品洗脱-薄膜过滤后贴在TSA培养基上培养无菌生长，而黑曲霉在SDA上可以正 ...

能不能不要搞AI整些废话

阿用oie

定量菌株复溶后有用振荡器摇匀吗？厂家说需要用振荡器摇匀大概十几秒，手摇的话菌落很容易聚集

游侠某

浓度低，菌液量少，洗脱次数多，都会影响