纯化水验证怎么检验洋葱伯克霍尔德菌

大橙子Cecelia

请教一下各位老师，纯化水做微生物验证时要怎么检验洋葱伯克霍尔德菌（它应该是控制菌检查吧，我不太了解）？我说一下我看药典上理解的验证操作方法，各位老师看一下哪里有没有不对的地方。
1试验组:取纯化水10ml过滤，再加1ml不大于100的洋葱伯克霍尔德菌过滤冲洗，贴到洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基，33℃培养不大于3天
2菌液对照组:10mlph7.0缓冲液和1ml洋葱伯克霍尔德菌过滤，滤膜贴平皿培养
3供试品对照组:10ml水缓冲液冲洗过滤，贴平皿培养
4阴性对照:缓冲液1ml过滤，滤膜贴平皿培养

最后计算回收率？还是说只看形态特征就可以了？

还有关于洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基适用性检查，药典上的五个菌 洋葱、新洋葱、神秘、铜绿、金黄，这写都是要做的吧。
它的适用性检查方法是把这些菌制成适宜的菌悬液，然后取不大于100cfu的菌液加入到洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基平板上然后用涂布棒涂布可以吗？培养温度和时间都是30-35度不大于三天吗？

麻烦各位老师指点我一下，非常感谢！

八档丶电风扇

1109里面有检验操作过程，举得例子就是纯化水

机智鼠

您所述方法基本符合《中国药典》通则1105非无菌产品微生物限度检查指导原则。建议注意：①回收率计算应采用标准曲线法或平行样定量测定；②选择性培养基适用性试验需按药典要求对洋葱伯克霍尔德菌等5种指示菌进行生长促进/抑制试验（详见通则4101），接种量宜控制在50-100CFU/平板，33±2℃培养不超过3天；③形态学观察仅作辅助鉴定，确证需结合生化反应或分子生物学方法。具体操作可参照ISO 11133水处理系统验证标准及GB/T 29872纯化水检测规范执行。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

世间始终你好

先说结论两点，帮你把“思路”掰正：

• 纯化水做“洋葱伯克霍尔德菌群（BCC）”方法学适用性属于《特定微生物检查》的范畴（等同于药典1106思路），不算微生物计数法（1105），因此不做回收率计算；判定是能否检测到目标菌、阴性是否无菌落、选择性培养基是否对目标/非目标表现出正确的增抑长特性。
  
• 接种（加菌）要在过滤之前与供试品一起进入体系，不能先把供试品过滤完再把菌滴到滤膜上——那样验证不到“基质/方法可能的抑制作用”。
  
  

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一、你列的验证步骤，推荐这样修正以膜过滤法为例（纯化水通常用膜滤，0.45 µm）：
1）试验组（供试品加目标菌）

• 取与日常检验一致的体积（建议100 mL纯化水；若前期探索阶段可小体积，但最终应与常规检验体积一致）。
  
• 加入**≤100 CFU的洋葱伯克霍尔德菌群代表株到这100 mL里，轻摇混匀后一起过滤**。
  
• 必要时用无抑制的冲洗液（如pH 7.0缓冲液，含中和剂与否视产品而定；纯化水一般可不洗或少量冲洗）冲洗滤膜。
  
• 将滤膜转贴BCC选择性琼脂（如培养基说明书/药典指定的选择性培养基），30–35 ℃培养，观察至72 h内（不超过3天），24/48/72 h逐次判读。
  
• 期望：出现典型/可疑的BCC菌落（形态按培养基说明书判读），并做至少一株的确认（见后述“确认”）。
  
  

2）阳性对照（方法阳性）

• 以pH 7.0缓冲液100 mL代替供试品，加**同量（≤100 CFU）**的BCC，其他同试验组。
  
• 期望：生长良好（证明方法/培养基可检出）。
  
  

3）供试品对照（方法阴性/基质空白）

• 纯化水不加菌，同法过滤并培养。
  
• 期望：无生长（排除污染；若个别杂菌生长需评估是否与选择性、环境或操作有关）。
  
  

4）阴性对照（试剂空白）

• 1 mL缓冲液（或与阳性对照同批缓冲液）过滤并培养。
  
• 期望：无生长。
  
  

以上为特定微生物检查的“方法学适用性”：不做回收率，而是看试验组与阳性对照均阳性、两类阴性对照均阴性即可判定方法对该基质有效。

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二、是否只看形态？——需要形态 + 必要的确认

• 选择性培养基上的典型菌落形态是第一步，但不能仅以形态判定。
  
• 推荐做至少一株的确认（任选典型菌落）：
  
  
  • 转接到非选择性培养基观察，再做生化/快速鉴定（如MALDI-TOF、商业鉴定卡），或使用第二种选择性/鉴别培养基进行复核；
    
  • 实验室条件允许时可用**分子法（如特异性PCR）**作进一步确认。
    
    
• 验证阶段记录：典型形态描述、确认方法与结果。
  
  

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三、关于“洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂”的培养基适用性检查（培养基自身验证）你提到的“五个菌（3株目标BCC代表株 + 2株非目标：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）”，都要做。思路是“生长促进性 + 抑制性/选择性”。
做法要点：

• 接种量：各菌制成适宜菌悬液，取**≤100 CFU**/平板。
  
• 接种方式：直接在选择性平板表面涂布（不用过滤），用无菌涂布棒均匀涂开。
  
• 培养条件：与实测一致，30–35 ℃，观察至72 h内（不超过3天），分时判读。
  
• 判定：
  
  
  • 目标菌（BCC代表株）：应能生长，并呈典型/预期形态；菌落数与接种量大致相符（允许选择性导致适度减少，但应清晰可检）。
    
  • 非目标菌（P. aeruginosa、S. aureus）：应被抑制（不长或极少、且不呈典型BCC形态）。
    
    
• 同时做一组非选择性平板（如TSA）生长促进性，确认所有试验菌处于可培养状态。
  
  

注：BCC为“菌群/复合群”，药典常列多株代表菌用于覆盖选择性谱。你实验室可按药典列名或培养基说明书推荐的ATCC/CMCC 等标准株开展。

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四、几个常见易错点（帮你对照排雷）

• 先滤后加菌（你原方案第1步）会低估基质/方法对检出率的影响，不符“方法学适用性”的本意——应与供试品同滤。
  
• 只看形态不够，至少要做一次确认试验。
  
• 体积不一致：验证体积应尽量与常规检验体积一致（通常100 mL），否则验证外推性差。
  
• 只做目标菌：培养基适用性需目标 + 非目标；而“方法学适用性”至少要有阳性对照 + 阴性对照，必要时加环境阴性。
  
• 读板太早：BCC在部分选择性基质上生长偏慢，建议24/48/72 h分时记录，最长不超过3天。
  
  

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五、日常检验提示（做完验证后的常规做法）

• 常规“纯化水 BCC 监测”多采用：一定体积（如100 mL）膜滤 → 选择性平板培养 30–35 ℃ ≤3天 → 典型菌落挑取确认 → 报告阴/阳性。
  
• 是否把BCC纳入纯化水的日常“控制菌”，取决于工厂产品谱和风险评估（尤其非无菌水性制剂/高风险外用水剂）。若纳入控制菌监测，方法学适用性就按上文一次性做足并归档。
  
  

科波拉陈

先看1109上面关于纯化水的检测方法。你这个直接过滤贴膜，这是计数法。BCC应该是控制菌的检测方式。