USP51抑菌效力 凝胶产品 试验方案

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最近在做一个凝胶产品的抑菌效力测定，第一次接触这个方法。

根据药典，写了一下测试流程。各位大佬帮忙看一下是否有问题。以及加粗部分的疑问求解答。

1.培养基促生长试验

是每个配制批次必做促生长试验还是每个批号的培养基只需做一次？

试验菌稀释至<100CFU/mL（可使用冻存菌株复苏后直接稀释接种）接种自制培养基、中检院对照培养基。

判定标准：

被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上菌落平均数的50%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。

菌株	接种量	培养基	培养温度	接种物培养时间
大肠埃希菌    （ATCC编号8739）	<100CFU/mL，可使用冻存菌株复苏后直接稀释接种	胰酪大豆胨液体培养基（海博自配、中检院对照培养基）    分别涂布两块平板	32.5±2.5℃	18~24 h
铜绿假单胞菌    （ATCC编号9027）
金黄色葡萄球菌    （ATCC编号6538)
白色念珠菌    （ATCC编号10231）		沙氏葡萄糖液体培养基（海博自配、中检院对照培养基）    分别涂布两块平板	22.5±2.5℃	44~52 h
巴西曲霉    （ATCC编号16404）				6~10天

2.计数方法适用性

供试品+菌组：

取1ml<100CFU/mL的新鲜培养物，加入到9ml稀释至10-1的供试品，混匀后，取1ml涂布计数，每个浓度需涂布2板。稀释至10-2、10-3的供试品同10-1操作。

如供试品有抑菌效果，则需要加入中和剂。（凝胶产品中含有乙醇，中和剂为吐温80，中和剂添加量如何确定？）

菌液对照组：

取1ml<100CFU/mL的新鲜培养物，加入到9ml生理盐水，混匀后，取1ml涂布计数，每个浓度需涂布2板。

中和剂对照组：

取1ml<100CFU/mL的新鲜培养物，加入到9ml（生理盐水+吐温80，吐温80添加量同供试品组），混匀后，取1ml涂布计数，每个浓度需涂布2板。

判定标准：

产品与菌种混合液的菌落平均数不小于阳性对照菌落平均数的50%，判该回收率检查符合规定。

菌株	接种量	培养基	培养温度	回收率培养时间
大肠埃希菌    （ATCC编号8739）	<100CFU/mL，新鲜培养物稀释接种    供试品稀释10-1、10-2、10-3    如供试品有抑菌效果，则需要加入中和剂（乙醇-吐温80）	胰酪大豆胨液体培养基    分别涂布两块平板	32.5±2.5℃	3~5天
铜绿假单胞菌    （ATCC编号9027）
金黄色葡萄球菌    （ATCC编号6538)
白色念珠菌    （ATCC编号10231）		沙氏葡萄糖液体培养基    分别涂布两块平板	22.5±2.5℃
巴西曲霉    （ATCC编号16404）				3~7天

3.供试品检查

新鲜培养物：菌株复苏接种培养，冲洗下来用比浊法稀释至1×108cfu/mL。

根据产品密度，用电子天平称取供试品，质量换算后凝胶产品的体积为5ml。将5ml供试品加入到15 ml离心管中，接种0.05ml浓度为1×108cfu/mL试验菌，涡旋5min，充分混匀。取1ml混合的供试品-菌液于离心管中，共分装4管。

Usp51中对供试品的检验量没有明确要求，只设置4ml是否合理？需要和微限检查一样设置检验量、检验数量吗？

刚分装完、D7、D14、D28各取1管进行取样计数。

稀释至10-3、10-4，每个稀释度取1ml涂布平板，最少进行2个平行。按照计算方法适用性的相同条件进行计数。

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还有一个问题，巴西曲霉的孢子如何调整至1*10^8CFU/ml？一是不好扩增出这么多，二是计数的问题，新鲜培养物的孢子如何计数、稀释啊？中检院的比浊管没有对应的。