IVD注册中：R2A培养基的适用性试验怎么做？

吴思奇

请问各位老师：R2A培养基的适用性试验怎么做的？有资料提供查阅吗？或者相关规程的范本？我这边找了一下质料。设想了一下：一组用铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌。进行培养，另一组阴性对照。33度培养5天。菌株来源于直接采购。各位老师麻烦看一下这样做适用性是否合适？

机智鼠

在医疗器械和药品注册过程中，R2A培养基的适用性试验是确保该培养基能够有效检测特定微生物的关键步骤。根据《中国药典》和相关生物制品检验指导原则，进行R2A培养基适用性试验时，应选择具有代表性的微生物菌株，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。这些菌株应从可靠的来源采购，并符合国家或国际标准。

试验方法如下：
1. 准备两组培养基，一组加入目标菌株，另一组作为阴性对照。
2. 将菌株接种到R2A培养基中，并在33°C条件下培养5天。
3. 观察并记录菌株的生长情况，包括菌落形态、颜色等特征。
4. 根据《中国药典》和相关指南，评估R2A培养基对目标菌株的敏感性和特异性。

请注意，以上仅为一般性建议，具体试验方法和要求可能因产品类型、用途和法规要求而有所不同。在进行R2A培养基适用性试验时，请务必参考最新的法规、指南和标准，以确保试验的准确性和合规性。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

世间始终你好

很好 — 你已经把关键点想到了（选用铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌、设置阴性对照、并有培养时间的想法）。下面把一个合规、可直接套用的R2A培养基适用性（计数培养基适用性）试验方案模板给你，并说明你方案里需要修改/补强的地方与理由，外加关键规范与技术资料的出处以便查阅。

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要点结论（先说结论，方便快速调整）

• 不要把孵育温度定在 33°C —— R2A 的优势在于低营养、低温长培养以恢复受应激/受氯杀伤的水源细菌。常规推荐 20–25°C（或宽松地 20–28°C）孵育 5–7 天（或在 20–25°C 下 72–168 小时）。若在 30–35°C 孵育时间会短但会降低对某些环境/受损菌的回收。
  
• 试验菌株与阴/阳对照：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是常用的质控菌株，可用；另外 pharmacopeia 类通则一般还建议包含金黄色葡萄球菌/大肠杆菌/酵母等用于计数培养基的适用性列表（可按你的风险/样品类型选补）。
  
• 接种量：每平板（或过滤膜）接种 ≤100 CFU（常取 10–100 CFU），并与对照培养基并行；评价用 被检培养基平均菌落数 / 对照培养基平均菌落数，比值 0.5–2.0 为合格（通则要求）。
  
  

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推荐的“适用性试验模板”（可复制进 SOP / 验证方案）目的
验证所配制/购买的 R2A 培养基（用于需氧菌总数/纯化水检测）能否良好回收常用对照菌株，满足《中国药典》通则对“计数培养基适用性检查/计数方法适用性试验”的要求。
参考
《中国药典》通则1105（计数培养基适用性）、R2A 厂家技术说明书 / EP / APHA 建议等。
材料与设备

• 待检 R2A 平板（按处方配制并灭菌或购买商用平板）
  
• 对照培养基（由检定单位/可靠来源提供，或常用的标准计数培养基如 PCA/TSB 作为对照）
  
• 质控菌株：P. aeruginosa（例如 ATCC 9027 或 CMCC(B)10104）、B. subtilis（例如 ATCC 6633 或 CMCC(B)63501）……（菌株编号记录）
  
• 无菌缓冲液（如 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 pH7.2 无菌磷酸盐缓冲液）
  
• 滴度计、稀释管、滤膜与过滤装置（如使用膜过滤法）、无菌接种环/移液器等
  
• 培养箱可设定 20–28°C
  
  

试验设计（示例）

• 菌液制备：取新鲜培养物按通则或菌株手册制备菌悬液，用无菌缓冲液稀释至目标接种浓度（例如 10–100 CFU/0.1 mL 或 10–100 CFU/滤膜）。为准确设定 CFU，需用平板计数或稀释-平板法事先回算。
  
• 分组与平行数：每个菌株在被检培养基上至少 2 平行，在对照培养基上至少 2 平行（薄膜过滤法对应的膜各两片/组）。同时设置阴性对照（稀释液/无菌水，检测培养过程中污染）若干平行。
  
• 接种方法：按你常用方法（平板平板法、倾注法或膜过滤法）执行。注意：若采用倾注法，要考虑热冲击（建议膜过滤或平板铺板以减少影响）。
  
• 接种量：每平板/膜 目标 ≤100 CFU（通常 10–100 CFU）。记录实际接种量（通过回算）。
  
• 孵育条件：建议主条件 20–25°C，5–7 天；也可并行做一个较高温度对照（例如 30–35°C，48–72 小时）以便比较，但适用性判定主依据低温长期培养结果（R2A 特色）。若必须用 30–35°C，说明理由并保留数据。
  
• 读数与判定：计数每个平板/膜上的菌落数（CFU），计算每株在被检培养基与对照培养基的平均菌落数之比（被检/对照）。判定标准：比值在 0.5–2.0 之间，且菌落形态与对照一致，即判为合格（若任一菌株超出需调查并采取纠正措施）。同时阴性对照要求无生长。
  
  

报告内容

• 菌株/批号、接种 CFU 回算、平行数数据表、各平板/膜照片（建议留档）、计算结果（比值）、判定结论、偏差/异常记录与处理建议。
  
  

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对你原先设想的具体建议（逐条）

• 你设想：“一组用铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌。进行培养，另一组阴性对照。33度培养5天。菌株来源于直接采购。”
  
  
  • 菌株选择：铜绿假单胞菌 + 枯草芽孢杆菌是合适的质控菌株之一。可接受。
    
  • 阴性对照：必须设置（合格要求：无菌落）。正确。
    
  • 孵育温度：强烈建议不要用 33°C 作为主条件；改为 20–25°C（或 20–28°C）孵育 5–7 天。如果你把温度设为 33°C，可能导致无法评价 R2A 在低温恢复受损/耐氯菌株的回收能力，从而无法通过常见法规/指南的适用性检查。你可以并行一个“快速条件”（如 30–35°C，48–72 小时）做对比，但主判定以低温长培养为准。
    
  • 菌株来源：建议使用有保存中心编号的标准株（如 ATCC、CMCC 等），并记录传代次数（通则要求传代不超过一定代数）。“直接采购”可以，但要确保是正规菌种并记录证书/编号。
    
    

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你可能要查阅 / 下载的具体资料（我帮你找到了可查看的资料）

• 中国药典 / 通则 1105（“计数培养基适用性检查”节）—— 通则详细给出菌种、供试液制备、判定 0.5–2.0 等要求。
  
• Sigma / Merck 等厂家的 R2A 技术说明书（含 QC 表、推荐接种量、推荐孵育条件）—— 可作方法参数参考。
  
• Humeau / 其他培养基厂家的 R2A 使用说明（含培养温度、时间与 QC 菌株列表）。
  
  

（如果你需要，我可以把上面这些 PDF/网页链接整理成一个短清单或把上面“试验模板”直接写成可贴入实验室 SOP 的段落。）

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简短行动项（建议的下一步）

• 把孵育条件从 33°C/5d 改为 20–25°C，5–7 d（或并行 20–25°C 与 30–35°C 两组进行对比，但以 20–25°C 作为判定依据）。
  
• 使用 标准保存中心菌株（ATCC/CMCC） 并记录批号与传代次数。
  
• 接种量控制在 10–100 CFU/平板或膜（≤100 CFU），并做最少两平行。
  
• 读数后计算 被检/对照 的比值，若全部菌株比值在 0.5–2.0，则培养基适用性通过。