平板划线法挑单菌落筛选复壮菌种

奥克泰士

发酵生产中，菌种的活力是关键因素之一，长时间储存或多次传代，菌种活力会下降，从而影响生产，因此需要定期复壮菌种，以免菌种活力衰退。平板划线法挑单菌落筛选复壮菌种就成为一个选择。小作文简述此过程，望对需要的蒲友有些帮助。

环湖

在发酵工业，尤其是对生产稳定性要求极高的疫苗、抗生素、酶制剂等行业，菌种活力的维持是生产成功的生命线。您提到的“平板划线法挑单菌落进行复壮”是经典且核心的菌种维护手段，但它不是全部。

下面我将系统性地为您梳理菌种衰退的原因、复壮的本质，以及如何将平板划线法科学地整合进一套完整的菌种管理策略中。

第一部分：为什么菌种会衰退？——知其所以然

菌种在长期储存和传代中活力下降，主要源于：

1.  自发突变与选择压力：在非最优条件下（如营养不足、代谢产物积累），生长快的低产突变株会逐渐在种群中占据优势，挤占高产菌株的生存空间。
2.  质粒丢失：对于携带重要质粒（如抗性基因、产物合成基因）的工程菌，不稳定的复制会导致部分菌株丢失质粒，丧失生产能力。
3.  生理状态衰老：多次传代导致细胞代谢机能整体下降，如同生物体的衰老。
4.  保存损伤：冷冻、冻干过程对细胞造成物理或化学损伤，部分细胞未能恢复。

第二部分：复壮的本质——找回“初心”

复壮的核心目标不是“创造”新菌种，而是通过技术手段，从退化的混合群体中，筛选并恢复出那些仍然保持或最接近原始优良性状的个体。

平板划线法，正是实现这一目标的关键第一步。

第三部分：平板划线法——如何科学操作而非简单“挑菌”

如果只是随意划线、随便挑个菌落，那几乎无效，甚至可能挑到更差的突变株。必须进行科学筛选：

1. 创造筛选压力（关键！）
   针对高产：在平板中加入前体物质、或使用只能被目标产物代谢利用的碳源。
   针对抗性：加入亚抑制浓度的抗生素（对于抗性标记菌株）。
   针对生长活力：使用营养相对贫瘠的培养基，只有生长力最强的菌落才能快速形成。
   形态初筛：高产菌株常伴有特定形态（如孢子丰富、色素分泌、菌落干燥皱缩等）。

2. 阶梯式筛选流程
   第一轮：初筛（大量） 划线获得数百个单菌落，根据形态快速初筛，淘汰明显劣化（如变小、变粘、变色）的菌落，保留20-50个候选。
   第二轮：复筛（微量） 将候选菌落接种至深孔板或小型摇瓶进行微量发酵试验，检测关键指标（如菌体密度、pH变化、底物消耗速率等），筛选出5-10个表现优异的菌株。
   第三轮：决选（小试） 将复筛出的菌株进行小规模发酵罐试验，全面评估其生长曲线、产物产量、遗传稳定性等，最终确定1-2个最优复壮菌株。

第四部分：超越划线——完整的菌种管理体系

平板划线是复壮的核心技术，但必须嵌入以下体系才能发挥最大效用：

1.  建立主细胞库和工作细胞库
       主细胞库：从经过充分鉴定的原始菌种制备，液氮超低温保存，原则上只取出不归还，是生产的“黄金标准”。
       工作细胞库：从主细胞库扩增制备，用于日常生产。规定最高传代次数（如从工作库种子到发酵罐不超过5代）。

2.  严格的传代规程
       明确记录菌种代次。
       使用最适培养基和条件进行复苏和扩增，避免因培养条件不佳人为导致退化。
       定期返回：定期（如每半年或每生产一定批次后）从主细胞库启封新的种子，刷新工作细胞库，从根本上避免长期传代。

3.  定期评估与复壮计划
       监测指标：定期检测工作种子的关键性能指标（生长速率、产物生成率、遗传标记稳定性等）。
       启动信号：当指标下降超过预设警报限（如产量下降10%），或达到规定的定期复壮周期时，立即启动复壮程序。
       完整记录：复壮全过程（筛选条件、各轮数据、最终决策）必须详细记录，形成菌种档案。

总结建议

对于您的生产，应建立以下标准操作程序：

1.  制定文件：编写《菌种管理规程》和《菌种复壮标准操作规程》。
2.  设计筛选：根据您的菌种和生产目标，与研发部门共同设计带筛选压力的平板培养基和阶梯式筛选方案。
3.  设定周期：规定工作库的最长使用时间/传代次数，以及定期复壮的强制周期（例如，每6个月或每20个生产批次后）。
4.  关联生产：将复壮后菌株的小试数据与历史生产数据对比，确认其恢复甚至超越原有水平后，方可投入生产。

记住：平板划线挑单菌落是“手术刀”，而完整的菌种管理制度是“手术方案”和“术后护理”。 只有两者结合，才能确保您生产线上始终奔跑着活力充沛的“冠军菌株”。