CHO细胞培养流加模式下细胞会一直分解增殖吗？

PGYPGYPGY2021

一般情况下，CHO细胞培养密度一天增加1倍，至密度达到峰值，后面在补料有营养供应，后面细胞还会持续培养7-10天，我好奇细胞密度从达到峰值到后面7-10天培养时会分解增殖吗？细胞的年龄在增加吗？是有的死，死了会马上生产新的细胞以维持稳定吗？

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夢梦夢梦夢

在 CHO 细胞密度达到峰值后，即便持续补料提供充足营养，细胞增殖会基本停滞，后续7-10天的培养阶段以维持活细胞密度稳定和目标蛋白表达为核心，细胞的年龄会持续增加，同时存在动态的生死平衡。具体可以分为3个关键点：
1. 增殖基本停止，不会再指数翻倍细胞密度达到峰值的核心原因是接触抑制和营养环境的增殖阈值触达——即便补料补充了氨基酸、葡萄糖等营养，细胞间的空间挤压、代谢副产物（如乳酸、氨）的累积，会直接抑制细胞周期的G1/S期转换，增殖相关基因（如Cyclin D）表达下调，细胞不再进入分裂周期。此时的细胞周期会停滞在G0/G1期，以“非增殖状态”为主，少数细胞可能因个体差异进入分裂，但整体增殖率极低，无法抵消死亡细胞的数量。
2. 细胞年龄持续增加，进入衰老阶段细胞的年龄可以从两个维度判断：
复制性衰老：CHO细胞虽为贴壁/悬浮传代细胞系，但每次分裂都会伴随端粒缩短，峰值后细胞不再分裂，端粒不再进一步缩短，但细胞内的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性会升高，线粒体功能下降，活性氧（ROS）累积。
功能性衰老：细胞的蛋白合成效率会逐渐下降，代谢速率减慢，抗逆性降低，这些都是细胞年龄增加的直接表现。
3. 存在动态的生死平衡，维持活细胞密度稳定峰值后的7-10天培养中，细胞死亡与少量新细胞生成会形成动态平衡，但这个平衡的核心是死亡主导，新生补充不足，活细胞密度会缓慢下降而非完全稳定。
细胞死亡的主要原因：代谢副产物毒性、细胞内衰老相关通路激活、部分细胞因营养竞争处于饥饿状态导致凋亡（Caspase 通路激活）。
新细胞的少量生成：极少数未进入G0期的细胞，会利用补料中的营养完成分裂，但比例极低（通常增殖率＜5%），无法完全替代死亡的细胞。
实际培养中的表现：活细胞密度会从峰值的1×10⁷~2×10⁷ cells/mL缓慢下降，7-10 天后可能降至峰值的60%~80%，具体降幅取决于补料策略和培养环境控制。
总的来说，CHO细胞密度达峰后，增殖基本停滞，细胞年龄持续增加，后续培养阶段是“衰老-死亡-少量新生” 的动态平衡过程，补料的核心作用是延缓细胞死亡、维持活细胞存活时间，从而最大化目标蛋白的表达量，而非促进细胞增殖。
可以看一下这篇CHO细胞培养关键过程的综述。

机智鼠

CHO细胞在流加培养模式下，理论上会持续分解增殖直至达到营养供应的限制或环境条件不再适宜生长。根据《生物制品生产质量管理规范》（GMP）和《中国药典》的相关规定，细胞培养过程中应定期监测细胞生长状态、活率及代谢产物等指标，以确保产品质量和安全性。

在细胞密度达到峰值后，如果继续补料提供营养，细胞可能会继续增殖一段时间（通常为7-10天），但增长速度可能放缓。此时，部分老龄细胞（即年龄较大的细胞）可能会出现死亡现象，而新生成的细胞则用于维持稳定的细胞群体。然而，需要注意的是，过度依赖新生成的细胞来替代死亡细胞可能会导致细胞群体中出现异常比例的老化细胞，从而影响产品质量。因此，在实际操作中，需要密切监控细胞的生长情况，并根据实际情况调整培养策略。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

PGYPGYPGY2021

夢梦夢梦夢 发表于 2025-12-11 11:50
在 CHO 细胞密度达到峰值后，即便持续补料提供充足营养，细胞增殖会基本停滞，后续7-10天的培养阶段以维持活细胞密度稳定和目标蛋白表达为核心，细胞的年龄会持续增加，同时存在动态的生死平衡。具体可以分为3个关键点：
1. 增殖基本停止，不会再指数翻倍细胞密度达到峰值的核心原因是接触抑制和营养环境的增殖阈值触达——即便补料补充了氨基酸、葡萄糖等营养，细胞间的空间挤压、代谢副产物（如乳酸、氨）的累积，会直接抑制细胞周期的G1/S期转换，增殖相关基因（如Cyclin D）表达下调，细胞不再进入分裂周期。此时的细胞周期会停滞在G0/G1期，以“非增殖状态”为主，少数细胞可能因个体差异进入分裂，但整体增殖率极低，无法抵消死亡细胞的数量。
2. 细胞年龄持续增加，进入衰老阶段细胞的年龄可以从两个维度判断：
复制性衰老：CHO细胞虽为贴壁/悬浮传代细胞系，但每次分裂都会伴随端粒缩短，峰值后细胞不再分裂，端粒不再进一步缩短，但细胞内的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性会升高，线粒体功能下降，活性氧（ROS）累积。
功能性衰老：细胞的蛋白合成效率会逐渐下降，代谢速率减慢，抗逆性降低，这些都是细胞年龄增加的直接表现。
3. 存在动态的生死平衡，维持活细胞密度稳定峰值后的7-10天培养中，细胞死亡与少量新细胞生成会形成动态平衡，但这个平衡的核心是死亡主导，新生补充不足，活细胞密度会缓慢下降而非完全稳定。
细胞死亡的主要原因：代谢副产物毒性、细胞内衰老相关通路激活、部分细胞因营养竞争处于饥饿状态导致凋亡（Caspase 通路激活）。
新细胞的少量生成：极少数未进入G0期的细胞，会利用补料中的营养完成分裂，但比例极低（通常增殖率＜5%），无法完全替代死亡的细胞。
实际培养中的表现：活细胞密度会从峰值的1×10⁷~2×10⁷ cells/mL缓慢下降，7-10 天后可能降至峰值的60%~80%，具体降幅取决于补料策略和培养环境控制。
总的来说，CHO细胞密度达峰后，增殖基本停滞，细胞年龄持续增加，后续培养阶段是“衰老-死亡-少量新生” 的动态平衡过程，补料的核心作用是延缓细胞死亡、维持活细胞存活时间，从而最大化目标蛋白的表达量，而非促进细胞增殖。
可以看一下这篇CHO细胞培养关键过程的综述。

谢谢！
这里面说细胞密度达到峰值后的7-10天，细胞龄在持续增加，这里的细胞龄指的同一群细胞不同时间的年龄(D10就是比D3年龄大)，还是细胞分裂增殖后的群体倍增水平(PDL)？

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夢梦夢梦夢

PGYPGYPGY2021 发表于 2025-12-15 07:30
谢谢！
这里面说细胞密度达到峰值后的7-10天，细胞龄在持续增加，这里的细胞龄指的同一群细胞不同时间的 ...

这里的细胞龄指的是时间年龄。
在理解 CHO 细胞高密度培养后期的 "细胞龄" 概念时，需要明确区分两个重要的概念：时间年龄和群体倍增水平（ PDL）。时间年龄的定义和特征相对直观。时间年龄是指细胞从接种或从某个特定时间点（如密度达到峰值的时间点）开始经历的培养时间。在 CHO 细胞密度达到峰值后的 7-10 天培养期间，时间年龄的增加是绝对的，即 D10 的细胞比 D3 的细胞 "年龄" 大 7 天。这种年龄的增加与细胞是否分裂无关，即使细胞完全停止增殖，时间年龄仍会持续增加。时间年龄的增加与细胞的功能衰退密切相关，包括代谢速率的下降、蛋白质合成能力的降低、抗逆性的减弱等。群体倍增水平的概念和计算则与细胞的增殖历史相关。
PDL 是指细胞群体经过分裂增殖后的总倍增次数，计算公式为：PDL = ln (终末细胞密度 / 初始细胞密度)/ln2。PDL 反映了细胞的增殖能力和分裂历史。然而，在 CHO 细胞密度达到峰值后，由于细胞增殖基本停止（增殖率通常低于 5%），PDL 的增加极其缓慢，几乎可以忽略不计。例如，如果达峰时的细胞密度为 1.5×10^7 cells/mL，7 天后由于死亡抵消了少量新生，活细胞密度为 1.0×10^7 cells/mL，计算得到的 PDL 仅增加约 0.26。
两种年龄概念的生物学意义存在本质差异。时间年龄反映了细胞在特定环境条件下的 "生理年龄"，即使细胞不分裂，随着时间推移，细胞内的分子损伤会累积，细胞器功能会衰退，基因表达模式会改变。这种年龄的增加与细胞的衰老直接相关，是导致细胞功能下降和最终死亡的主要原因。相比之下，PDL 主要反映细胞的 "增殖年龄"，与细胞的分裂历史相关。在高密度培养后期，由于细胞停止分裂，PDL 已不能准确反映细胞的状态变化。

Linmumu111

请教一下，如果采用灌流的模式的话，细胞的生长和死亡还是一样的吗？

PGYPGYPGY2021

夢梦夢梦夢 发表于 2025-12-16 10:59
本帖最后由 夢梦夢梦夢 于 2025-12-16 11:02 编辑


这里的细胞龄指的是时间年龄。
在理解 CHO 细胞高密度培养后期的 "细胞龄" 概念时，需要明确区分两个重要的概念：时间年龄和群体倍增水平（ PDL）。时间年龄的定义和特征相对直观。时间年龄是指细胞从接种或从某个特定时间点（如密度达到峰值的时间点）开始经历的培养时间。在 CHO 细胞密度达到峰值后的 7-10 天培养期间，时间年龄的增加是绝对的，即 D10 的细胞比 D3 的细胞 "年龄" 大 7 天。这种年龄的增加与细胞是否分裂无关，即使细胞完全停止增殖，时间年龄仍会持续增加。时间年龄的增加与细胞的功能衰退密切相关，包括代谢速率的下降、蛋白质合成能力的降低、抗逆性的减弱等。群体倍增水平的概念和计算则与细胞的增殖历史相关。
PDL 是指细胞群体经过分裂增殖后的总倍增次数，计算公式为：PDL = ln (终末细胞密度 / 初始细胞密度)/ln2。PDL 反映了细胞的增殖能力和分裂历史。然而，在 CHO 细胞密度达到峰值后，由于细胞增殖基本停止（增殖率通常低于 5%），PDL 的增加极其缓慢，几乎可以忽略不计。例如，如果达峰时的细胞密度为 1.5×10^7 cells/mL，7 天后由于死亡抵消了少量新生，活细胞密度为 1.0×10^7 cells/mL，计算得到的 PDL 仅增加约 0.26。
两种年龄概念的生物学意义存在本质差异。时间年龄反映了细胞在特定环境条件下的 "生理年龄"，即使细胞不分裂，随着时间推移，细胞内的分子损伤会累积，细胞器功能会衰退，基因表达模式会改变。这种年龄的增加与细胞的衰老直接相关，是导致细胞功能下降和最终死亡的主要原因。相比之下，PDL 主要反映细胞的 "增殖年龄"，与细胞的分裂历史相关。在高密度培养后期，由于细胞停止分裂，PDL 已不能准确反映细胞的状态变化。

时间年龄好理解，不讨论。
我的问题集中在细胞稳定期后它的群体倍增水平(PDL)是否在增加？如果有增加，怎么评估(计算)增加了多少PDL？

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PGYPGYPGY2021

机智鼠 发表于 2025-12-11 12:42
CHO细胞在流加培养模式下，理论上会持续分解增殖直至达到营养供应的限制或环境条件不再适宜生长。根据《生物制品生产质量管理规范》（GMP）和《中国药典》的相关规定，细胞培养过程中应定期监测细胞生长状态、活率及代谢产物等指标，以确保产品质量和安全性。

在细胞密度达到峰值后，如果继续补料提供营养，细胞可能会继续增殖一段时间（通常为7-10天），但增长速度可能放缓。此时，部分老龄细胞（即年龄较大的细胞）可能会出现死亡现象，而新生成的细胞则用于维持稳定的细胞群体。然而，需要注意的是，过度依赖新生成的细胞来替代死亡细胞可能会导致细胞群体中出现异常比例的老化细胞，从而影响产品质量。因此，在实际操作中，需要密切监控细胞的生长情况，并根据实际情况调整培养策略。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

稳定期后新生成的细胞，它的PDL怎么算？

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