细菌内毒素检测供阳无法凝固，出现浑浊

laokuang

各位老师：

我们有一款单链小核酸产品检测内毒素，发现供阳无法凝固，出现浑浊的情况。
目前，已经尝试增加稀释倍数，添加镁离子，pH也是在正常范围内，渗透压也与其它产品相近。
想咨询各位老师有没有其它方法。

机智鼠

各位同仁：

针对您提到的单链小核酸产品在细菌内毒素检测中出现供阳无法凝固且浑浊的情况，建议从以下几个方面进行排查和优化：

1. **检测方法确认**：确保使用的细菌内毒素检测方法（如鲎试剂法）适用于您的产品类型。根据《中国药典》2020年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”，选择合适的检测方法。

2. **样品处理**：检查样品制备过程是否可能引入干扰因素。例如，样品中的盐分、pH值、温度等条件是否适宜。参考《中国药典》2020年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”中关于样品处理的具体要求。

3. **试剂选择**：考虑使用不同厂家或批次的鲎试剂，以排除试剂本身的问题。同时，确保鲎试剂在使用前符合规定的储存条件。

4. **稀释倍数调整**：虽然已经尝试增加稀释倍数，但仍需进一步优化，确保样品浓度在检测范围内。参考《中国药典》2020年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”中关于稀释倍数的规定。

5. **环境控制**：确保实验环境的温度、湿度等条件符合要求，避免外界因素对检测结果的影响。

6. **专业咨询**：如果问题仍未解决，建议联系专业的第三方检测机构或咨询相关领域的专家，获取更具体的指导。

希望以上建议能对您有所帮助。如有进一步问题，欢迎随时交流。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

城里人hh

单链小核酸（如siRNA、ASO等）可能通过以下方式干扰鲎试验（LAL）：
非特异性结合：带强负电荷的核酸骨架可能非特异性地结合鲎试剂中的凝固酶原、凝固蛋白或甚至内毒素本身，阻断级联反应。
螯合作用：核酸可能螯合反应必需的二价阳离子（如Ca²⁺），虽然添加了Mg²⁺，但Ca²⁺的浓度可能仍不足或被竞争。
空间位阻或聚集：高浓度的核酸可能形成聚集物，导致浑浊，并物理性地阻碍凝胶形成。
酶抑制：某些核酸序列或修饰可能直接抑制鲎试剂中的关键酶（如C因子、B因子等）。

解决策略
1. 进一步优化反应体系
钙离子补充：在添加镁离子的基础上，系统性地补充氯化钙（CaCl₂）。鲎试剂凝固级联反应最终步骤需要Ca²⁺。可以尝试在供试品溶液或反应体系中加入终浓度2-5 mM的CaCl₂。注意，Ca²⁺浓度过高也可能抑制反应，需做梯度测试。
稀释剂的选择：
使用内毒素检测专用的无干扰稀释剂（如LAL Reagent Water, LRW），而非普通注射用水或缓冲液。
尝试使用含有表面活性剂（如Tween-20、Tween-80）的稀释剂。极低浓度（如0.01%）的表面活性剂可以减少核酸与反应成分的非特异性吸附，并可能澄清溶液。务必验证该表面活性剂本身对内毒素检测无干扰。
改变预孵育条件：将样品与鲎试剂混合后，在37℃孵育前，先在室温（如22-25℃）静置5-10分钟，让反应缓慢启动，有时有助于形成均匀凝胶而非浑浊沉淀。
2. 样品前处理
热处理：将样品溶液在70-80℃加热5-10分钟，然后迅速冰浴。此步骤可能使内毒素聚集体分散，同时改变核酸的二级结构，减少其干扰。但需确认该温度不会导致核酸降解。
pH短暂调整法：将样品用pH极端的缓冲液（如pH 11-12的碱或pH 2-3的酸）短暂处理（几秒到几分钟），然后迅速中和至pH 6.8-7.2。这可以破坏某些干扰物的结构。操作需谨慎，并做回收率验证。
超滤或透析：使用截留分子量远小于核酸产品、但大于内毒素（10 kDa）的超滤离心管，换用合适的缓冲液（如LRW）。此方法能有效去除小核酸产物中可能的可溶性干扰物，但步骤繁琐，且需确保内毒素不被吸附损失。
3. 方法学验证与替代方案
进行“加标回收率”实验：这是判断干扰的金标准。
将已知浓度的内毒素标准品（如1.0 EU/mL）添加到产品溶液中，与添加到LRW中的对照进行比较。
如果回收率不在50%-200%的可接受范围内，则证实存在干扰。
通过上述方法（稀释、添加离子、热处理等）处理后，再进行加标回收实验，验证方法的有效性。
更换鲎试剂品牌或类型：
不同厂家鲎试剂的配方（缓冲体系、稳定剂）不同，对干扰的耐受性可能不同。
考虑使用重组C因子法（rFC） 。该方法基于重组蛋白，特异性更高，不受(1,3)-β-D-葡聚糖干扰，且对某些传统LAL干扰物（如特定酶抑制剂）的敏感性也不同，可能完全避免遇到的问题。这是目前行业发展的趋势。
考虑替代检测方法：
如果经过最大有效稀释（MVD）后干扰仍无法消除，且所有尝试均失败，需考虑兔法热原检查作为替代方法。但这通常是最后的选择，且需进行充分的方法学验证和审批（如适用）。

豊衢

加EDTA-Tris缓冲液试试？

laokuang

豊衢 发表于 2026-1-8 14:59
加EDTA-Tris缓冲液试试？

这个有成品的试剂卖吗？

豊衢

laokuang 发表于 2026-1-8 15:20
这个有成品的试剂卖吗？

厦门鲎试剂厂就有TE缓冲液卖的吧

laokuang

豊衢 发表于 2026-1-8 15:53
厦门鲎试剂厂就有TE缓冲液卖的吧

非常感谢