检验方法的确认报告

晓青

各位：
   有关检验方法的确认目前有不同的看法和做法，前面发的检验方法的验证和确认规程中“检验方法的确认”实际操作起来很麻烦，对于品种规格剂型少的企业来说不太困难。而我们170个品种规格十几个剂型的企业来说面临人力、财力、物力的巨大消耗。经咨询有关专家认为可以以另外一种方式来对检验方法进行确认。本人拟定了一个范本“小柴胡颗粒检验方法的确认”，目前尚未初稿，现发上来，希望大家多提意见。另外，这种做法是否可行？也希望得到指正。谢谢 小柴胡颗粒检验方法确认报告.rar (833.72 KB, 下载次数: 843)

2011-12-23 09:37 上传

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一、 概述：

    小柴胡颗粒收载于中国药典2010年版一部，本公司生产的规格为：每袋10g，其检测主要内容为：

1．性状：本品为黄色至棕褐色颗粒；味甜。

2．鉴别

2.1 取本品6g，研细，加乙醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加盐酸调PH值至2～3，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄苓苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照SOP-QC-240-01试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5：3：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.2 取甘草对照药材1g，加水适量，煎煮30分钟，取出，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照SOP-QC-240-01试验，吸取上述鉴别项下的供试品溶液10μl与上述对照药材溶液5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（40：10：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

    2.3 取本品6g,加水20ml搅拌使溶解,离心,取上清液,加在聚酰胺柱(100～200目,8g,内径为2.5～3cm,湿法装柱)上,分别用水、20%乙醇和50%乙醇各100ml洗脱，收集50%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材1g，加水适量，煎煮1.5小时，滤过，滤液浓缩至约10ml，加在聚酰胺柱（100～200目，4g，内径为2cm，湿法装柱）上，分别用水100ml和50%乙醇150ml洗脱，收集50%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照SOP-QC-240-01试验，吸取供试品溶液2～10μl和对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（12：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

3.检查

3.1 装量差异：取本品10袋，照SOP-QC-548-01检查，应符合规定。

    3.2 粒度：取本品适量，照SOP-QC-549-01检查，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得过15%。

3.3 水分：取本品适量，照SOP-QC-052-01检查，不得过6.0%

3.4 溶化性：取供试品1袋，加热水200ml，搅拌5分钟，立即观察，应全部溶化或呈混悬状。可溶颗粒应全部溶化，允许有轻微浑浊。

3.5 外观质量：颗粒剂外观应干燥、颗粒均匀、色泽一致，无吸潮、结块、潮解等现象。

3.6 微生物限度：取本品，照SOP-QC-040-01检查，细菌数不得过1000cfu/g，霉菌数和酵母菌数不得过100cfu/g，不得检出大肠埃希菌及活螨。

4 含量测定（高效液相色谱法）

4.1 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）为流动相；检测波长为315nm。理论板数按黄苓苷峰计算应不低于3000.

4.2 对照品溶液的制备：取黄苓苷对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得（每1ml含黄苓苷60μg）。

4.3 供试品溶液的制备：取装量差异项下的供试品，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.4 测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，

注入液相色谱仪，测定，即得。本品每袋含黄苓以黄苓苷（C21H18O11）计不得少于20.0mg。

  以上是具体内容（分节发），大家提出意见

咕咕

二、方法确认的项目

为了了解其检验方法的可靠性，我们对其主要项目：三项鉴别和含量测定进行方法确认。其余常规检查项目则不必确认，微生物限度的验证另行进行验证。

   确认方法：采用三批小柴胡颗粒（批号为：20111014、20111018、20111020 ），按照标准中三项鉴别和含量测定的方法进行操作，对以上内容进行相关内容按以下表格逐一确认。

项目	确认内容	确认结果
鉴别1确认 取本品6g，研细，加乙醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加盐酸调PH值至2～3，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄苓苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照SOP-QC-240-01试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5：3：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。 经过三个批次的检测，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点。 鉴别2确认 取甘草对照药材1g，加水适量，煎煮30分钟，取出，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照SOP-QC-240-01试验，吸取上述鉴别项下的供试品溶液10μl与上述对照药材溶液5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（40：10：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。 经过三个批次的检测供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点。	仪器：万分之一天枰 已经检定，     在有效期内。 超声波处理器 应正常 试剂：    乙醇为分析纯    盐酸为分析纯    乙酸乙酯为分析纯    甲醇为分析纯    丁酮为分析纯    甲酸为分析纯 1%三氯化铁乙醇溶液配制记录完整正确。 对照品：黄芩苷         来源：中检所         批号：715-200111 对照品与样品的斑点颜色位置一致（见所附薄层图） 操作人员：已经过培训           操作过程正常 试剂    正丁醇为分析纯    甲醇为分析纯    三氯甲烷为分析纯    5%香草醛硫酸溶液配制记录完整 正确。 对照品：甘草对照药材         来源：中检所         批号：102904-200914 操作人员：已经过培训           操作过程正常 对照品与样品的斑点颜色位置一致（见所附薄层图）	√ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √

     

咕咕

项目	确认内容	确认结果
鉴别3确认取本品6g,加水20ml搅拌使溶解,离心,取上清液,加在聚酰胺柱(100～200目,8g,内径为2.5～3cm,湿法装柱)上,分别用水、20%乙醇和50%乙醇各100ml洗脱，收集50%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材1g，加水适量，煎煮1.5小时，滤过，滤液浓缩至约10ml，加在聚酰胺柱（100～200目，4g，内径为2cm，湿法装柱）上，分别用水100ml和50%乙醇150ml洗脱，收集50%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照SOP-QC-240-01试验，吸取供试品溶液2～10μl和对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（12：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。经过三个批次的检测，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点。	试剂  以上相同试剂已经过确认5%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液：配制记录完整 正确。仪器：紫外光灯      仪器正常      紫外灯使用时间在期限内对照品：柴胡对照药材     来源：中检所     批号：120992-201007操作人员：已经过培训          操作过程正常对照品与样品的斑点颜色位置一致（见所附薄层图）	√√√√√√√√ √√ √
含量测定的确认  色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）为流动相；检测波长为315nm。理论板数按黄苓苷峰计算应不低于3000.  对照品溶液的制备：取黄苓苷对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得（每1ml含黄苓苷60μg）。  供试品溶液的制备：取装量差异项下的供试品，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。4.4 测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。  本品每袋含黄苓以黄苓苷（C21H18O11）计不得少于20.0mg。	仪器Agilent1260液相色谱仪：经云南计量测试技术研究院检定合格证书编号：2011ZLHyx-00165号色谱柱：汉邦Kromasil C18 4.6 x250检测波长：315nm柱温：30°流速：1ml/min流动相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）超声波处理器：（功率250W，频率50KHz）试剂：甲醇：色谱级乙醇：分析纯对照品：黄芩苷        来源：中检所        批号：715-200111操作人员：已经过培训          操作过程正常含量：   20111014  36.21mg   20111018  33.96mg   20111020  33.66mg（液相色谱图附后）	√ √√√√ √ √ √√ √√√√ √√√

三、方法确认的结论

由以上结果可以看出，小柴胡颗粒标准中主要项目经过确认：

鉴别分离度好，对照斑点和样品的斑点位置、颜色一致，操作简便，重复性好，方法可行，适应本公司人员的操作。

含量操作简便，分离度、理论塔板数均能达到要求，能反映出小柴胡浸膏到颗粒过程中，黄芩苷含量的一致性。方法可行，适应于本公司人员的操作。

咕咕

第一问题：日常检测品种还要进行方法确认吗？

咕咕

2、含量测定确认至少包括精密度和专属性确认
3、结论：方法确认应是适用于品种而不是人员。

jhkui1326

{:soso__18042373804663603195_2:}  看看，学学

lingzhong

咕咕 发表于 2011-12-23 11:05
2、含量测定确认至少包括精密度和专属性确认
3、结论：方法确认应是适用于品种而不是人员。

后面的三个问题是你的？
楼主的东东只能是处于没做、做了≈没做、做了基本符合、做了完全符合的第二种阶段。

不过对于品种多的公司，这件事情的确扯蛋，我认为这种法规可以视为约束公司未来产品

晓青

谢谢各位的建议，希望越多越好

晓青

至于专属性，在制定的时候我也考虑过了，但是又要制备阴性液，还是有些麻烦；精密度我是以计量检定报告来加以控制。

咕咕

lingzhong 发表于 2011-12-23 11:59
后面的三个问题是你的？
楼主的东东只能是处于没做、做了≈没做、做了基本符合、做了完全符合的第二种阶 ...

后面的问题是针对楼主题目而提出或是一些看法

903

建议：
1、鉴别（2）（3）项中吸取对照药材溶液的量及吸取供试品溶液的量应该明确是多少μl；
2、含量测定项确认中，应对系统适应性试验中分离度有显示，并应提供对照品溶液连续进样5次的色谱图和RSD值以证明系统的重复性。

qyhmj

确认是该方法在你的试验室的适应性，俩次检测结果对比相对偏差的比较

zhou04

谢谢分享！！

mnou

学习下验证,大家多讨论

wuguanghui953

学习学习。

男儿当自强

觉得很不错，谢谢

那夜无风

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kunonline

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