怎样提高目标蛋白吸附到DEAE-Sephrose Fast Flow介质的量

清歌一曲月如霜

各位做蛋白纯化的高手好，我现在在纯化人血浆中的一种蛋白，分子量52kDa，等电点4.55，前处理采用还原剂打断杂蛋白的二硫键（不影响目标蛋白），气相二氧化硅吸附脂蛋白。
上柱子前的蛋白含量为7mg/ml，平衡液为50mM pH 7.5的Tris，在平衡液中增加NaCl盐浓度0.05M、0.1M、0.15M、0.2M梯度洗脱，通过活性测定和SDS-PAGE电泳发现0.05NaCl洗脱杂蛋白，0.1MNaCl洗脱目标蛋白。
存在的问题是未结合在介质上峰很大，里面也有不少目标蛋白，活性比0.1MNaCl洗脱峰的活性还高。
我已经尝试提高平衡液的pH到8.0，其余都不变，效果还不如原来，未结合峰的活性更大。该怎样改变条件才能提高目标蛋白在介质上的结合量呢？求各位前辈指点迷津，感激不尽。
以下是我的AKTA层析图谱，第一个是pH 7.5，第二个是pH8.0




这五个峰分别是未结合（峰很高）、0.05M、0.1M、0.15M、0.2MNaCl洗脱


这五个峰分别是未结合（峰很高）、0.05M、0.1M、0.15M、0.2MNaCl洗脱，后面是机器不稳定造成的峰

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我是这样想的：1.我没测过前处理上样前样品的电导率，也没透析，因为是预实验，就想大致看一下，最好是样品能处于平衡液那种状态下，吸附最准了，下次在做时决定透析一下，置换溶解蛋白的溶液为平衡液。2.提高平衡液的pH，我以前用试管法（介质装在试管中，不断用平衡液洗涤平衡，吸取上清液，再加平衡液洗涤，最后加杨平，测上清液的活性和蛋白含量）试过目标蛋白在pH7.0,7.5,8.0,8.5条件下，哪个吸附效果最高，结果是随着pH值的升高，上清液的活性也升高，说明目标蛋白没吸附上，pH7.0,7.5吸附情况差不多，这次用AKTA试果然pH 8.0效果不如7.5，所以要不要降低pH，换Tris为PBS？3.我的流速是2ml/min，上样和洗脱都是这个速度，还要降低吗？4.文献中都用的DEAE这个胶，或者是比较几种胶的效果，发现还是DEAE弱阴离子胶好一点。
啰嗦了这么多就是不知道下一步该怎么办，实验卡住了，希望找个师兄师姐好好讨论一下，

清歌一曲月如霜

首先介质本有自己性能，即自身的动态载量，这个载量会随着样品的性质发生改变，也会随流速改变。有较大的穿透，证明在该条件下已达到你的动态载量。
我个人介意从以下几个方面入手：1、降低平衡液电导与样品电导。之前你用还原剂，样品中电导值必然会比较高。通过稀释降低电导值。2、提高上样pH,你也尝试了，可以进一步探索，在保证蛋白性质不改变情况下。3、降低流速，高流速下，结合性能下降。3、更换介质，DEAE属于弱阴离子交换，可以换成强阴离子试试。你的基架，琼脂糖的，可以换成其他种类，推荐你可以试试 ABI的POROS Q



1、透析或者用超滤离心管换液至平衡缓冲液，可以有效降低样品电导值。2、既然pH你已经做过实验了，影响不大，那平衡液的电导值呢？ 50mM的浓度你是怎么得来了，一般都会产用20mM作为起始离子强度，若结合效果好，可再进一步优化。既然你为了保证不穿透，可以尝试降低你的平衡液浓度，10mM 20mM均可。3、 流速，你给我的是体积流速，你柱子是多少尺寸的，你可以自己换算下，推荐线性流速100cm/h时，看有木有增加你的结合量。4、缓冲液阴离子一般就用Tris 其PK大概在8.0左右，缓冲效果好，无需更换成PB