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本帖最后由 梦魂牵绕♂ 于 2014-11-22 11:34 编辑
随着工作性质的变化，我已经不再直接从事药品检验工作了，但QC部门仍然是责任部门之一，经常会发现在检验过程中由于对检验本身存在着不理解，造成不必要的麻烦、浪费或纠结，在对供应商进行审计时也会发现这种情况。
下面的内容基本上都是本人多年来的思想汇总，并不会在哪本书中或权威机构的出版物中出现，甚至与之相冲突，我也不想谁对谁错，但更希望我们能过检验本身有所理解，而不是片面的强调出处。只要对检验理解了，一理通百理通，你就会觉得：检验就是那么一回事。
1、概念
为什么要从定性、定量和限量这个角度开始呢？因为这是一切检验的核心，只有了解了这一点，你才可能目的明确，确保检验结果与你的要求是一致的，否则可能会造成杀鸡用了牛刀，浪费了时间和金钱，也可能会杀牛用了鸡刀，检验结果不准确、不可信。
定性检验是指确定某种成分或基团存在的可能性。一般就是指鉴别，一些性状项也可以认为是定性检验，例如熔点、折光率等。
定量检验比较好理解，就是指定量测定出某种成分的含量，表现为具体数值。一般来说最典型的就是指含量测定，也包括一些检查项下的项目，例如溶出度、水分等；当然在有些情况下，鉴别和性状检验也会转化成定量检验，例如紫外鉴别本身是定性检验，但如果方法中规定了吸收系数，则检验就转化成了定量检验。
限量检验是指不以明确的数值来测定某种成分含量的方法。典型的如氯化物、砷盐等检验。
要注意：限量检验和限度检查是完全不同的两回事！限度检查即可能是限量检验，也可能是定量检验，甚至会与你的目的直接相关。例如原料药的残留溶剂，对于生产企业来说，应该采用定量的方法测定，以验证你工艺的连续性；而对于原料药使用单位，则可以只需进行限量检验，因为残留溶剂在贮存过程中只会减少（极特殊的除外），所以只需要确认是否符合要求即可（这与中国官方的说法可能并不一致，官方的方法中是定量还是限量在方法描述中已经阐明，而且一些官员也并不理解这些，因此只能而且必须照做）。
2、定性、定量和限量检验与称量的关系
在药典凡例中有几种和称量有关的名词，分别是称取（或者叫“取”）、约、精密称定、称定。
精密称定，一般只用于定量测定，往往与“约”相连，也就是认为在标准称量正负10%范围之内可以认为是呈线性关系的，而不需要你一定称量到一个非常精确的很小的范围之内。这是因为你称量只要在10%范围内，检测的结果都可以通过计算而得以校正。最可笑的是，在很多标准中，很多限量检测也使用了“约”和“精密称定”的结合，而没有任何地方可以校正这种称量，比如说方法是目视比色法，这种方法的制定表明起草、审核和批准的人对“精密称定”和“约”的用法根本不了解。基于上述原因，如果使用“精密称定”这样的要求，就不需要在称量规定值数字后面再加上多少个零了，例如0.3g，而不需要0.30g或者0.300g了，因为结果都是一样的，加那么多零只是增加了无知的本性。
称定，这个词可以说是对限量检验最完美的诠释！其实我个人认为中国药典中对这个词的解读是非常不合适的，可能最关键的是引入了所谓“四舍六入五留双”的概念，我个人对这个概念非常不理解，而且可能也是各国药典中的中国特色，进而造成了你在称量时需要考虑下一位的修约情况。举例中国药典凡例：“称取0.1g，指0.06g-0.14g；称取2g，指1.5g-2.5g；称取2.0g，指1.95g-2.05g。”那么我想问，如果我想称取0.1g，但我只有千分之一天平，那么称取0.054g行不行？修约也是0.1g呀！看来教条主义“砖家”没有考虑到我这么“钻牛角尖”的人。我觉得在欧洲药典上对称量的理解和使用是最好的！什么是称取，是指称量范围至规定称量值下一位正负5范围内，也就是说按四舍五入修约应与规定值一致（中国本意是指按四舍六入五成双原则修约后与规定值一致，但考虑不周全）。关于数据修约我将会另起章节去分享。
再说“称取”的应用。为什么说它是对限量检验最完美的诠释？因为它的范围与限度值是密切相关的，反过来说，你设定什么样的限度，就应该设定什么样的“称取”规定值！举例，如果你的标准规定不得过10ppm，那么只有一位有效数字，你的样品“称取”的规定值应不得少于2位有效数字，例如你需要称取2.0g，而不是2g，此时1.95和2.05是相同的效果，不信你可以用计算器算一下，再修约看看；当然如果限度值的首位数字比称取值的首位数字大时（首位相同时可再看一下位，一般限度检查除残留溶剂外很少有三位的），应试设定多一位有效数字的称量规定值，例如还是前面的例子，当标准规定值为50ppm时，你应设定的称取规定值应为2.00g，而不再是2.0g。
而对于有些检测单位，即使是限度检查也喜欢做平行样，但又不好计算平均值时（比如两位样品要计算平均流出时间），只要你称取规定值设定的合理，就并不需要你再折算两位样品的重量而可以直接平均了（关于平行样品我会另起章节分享）。
称取这个词在国内的标准中应用可能是最烂的了，大家可以充分理解了上文后，再看一下欧洲药典的各论，以加深认识。
检验那回事之二——检验与验证
第二个话谈谈验证，这里所说的验证不光是指方法验证，还包括一个仪器设备确认（有些单位也叫验证，不过国外一般称之为Qualification，一般译成确认），甚至还有一个叫做系统适用性试验。
看似简单的检验，其实需要建立在相当的一定层面上。
检验可以理解为一个金字塔，最底层也是最关键的是仪器设备确认，试想你的仪器都不好使，你检出的结果怎么能够相信。举个例子，你有一把尺子，上面刻度是英尺，你当成米尺来用，那么无论它的精度有多高，你测出的结果都是不准的；再举个例子，你的天平最小称量已经到了50mg了，你还想用它了称20mg的对照品，那结果怎么能保证准确呢！
仪器确认再往上是方法验证。方法验证中也包括了确认、交叉验证、转移验证等内容，不外乎是你需要做什么样的试验，来确保你检测结果是可信的，在你的实验室是可以实现和完成的。
再往上是系统适用性试验，这可能也是国内大家做得比较少的，往往药典对它也不是太关注，顶多是有点重复性的概念。其实以下几个方面我个人认为也可以是系统适用性试验的一部分，它包括空白干扰、对照品检查（即双份对照品的平行性检查）、括号对照品检查（即检查系统没有发生漂移，以及溶液稳定）、有关物质的定量限、分离度（包括峰谷比）等。只有建立在这个系统适用性试验通过的基础上，本次试验的结果都是可信的，否则连你自己都说不服自己。
1、仪器设备确认
这是个在新版GMP中引进的概念，在比较早的时候更多的只有工艺验证、生产设备和公用工程系统等概念为大家所熟知，其实这个概念已经由来已久，简单的理解可以说是3Q（对于分析仪器基本上不需要设计确认，都是成型的东东，顶多需要个URS），再加上个校准就差不多了。
可能国内很多单位甚至一些所谓的“砖家”（局、所的一些人员）认为检定就是仪器设备的全部，其实我个人对检定是最不感冒的：第一，仪表、标准器械类的一定没有问题的；第二，仪器设备类的可能与我们行业的要求有很大不同，与我们用户需要就更不用说了；第三，有很多所谓的检测连方法都没有，今天和明天的做法都不同，你凭什么相信他；第四，很多检测是没有标准的，就给你一个结果，你自己看去（我为什么用你做？）；第五，有相当一部分根本就不做，有些让客户自己做，让他做还有什么意义，只是收钱而已。在我看来，仪器设备的检定、检测那是给一些官老爷们看的，确认才是给自己用的（很多官老爷不懂也不看）。
目的明确了，确认也就好做了。
IQ不外乎是要看一下水、电、气、环境、东西是否正确齐全、安装人员的资质、软件等等是否符合要求，与你的合同是否一致。
OQ主要是看你的仪器设备是否能够正常运行，包括功能键、密码等是否能够正确通过；仪器设备的主要指标是否能够满足。
PQ主要是看仪器设备是否能够满足用户的需求。
有很多仪器设备的OQ和PQ并不一定能够界定得很清楚，你也没有必要一定强行去划分，最重要的是能够满足你的要求，而且没有必要做多次重复和工作。还有很多仪器设备并不需要进行OQ和PQ，甚至同一仪器目的不同也会有所差别，例如一台干燥箱，如果用于干燥对照品或检测干燥失重，那么你不需要进行确认，但如果你只是烘玻璃仪器，那你就不需要进行OQPQ确认了；还有一些仪器，由于每次使用都需要进行校准，那么这种仪器对于所谓的确认要求也可以降低，例如pH计等；还有一些仪器设备，他的作用只是辅助的，准确与否对你实验的结果影响不大，这时你也不需要进行确认，例如离心机、磁力搅拌器等。
天平在所有仪器设备里是一种比较特殊的仪器，除了需要进行正常的确认外，还要每天进行日校（更合适的应该叫做日常检查），包括每次关闭电源。这是因为天平在检验中非常关键，而且本身也容易受各种条件的影响而发生偏移。当然我个人觉得在进行日校时应当设立警戒限和行动限，所谓警戒限就是指当天平超出这个值时你要做重新校正（例如内校或外校），以使之不会再发生更大的偏移；所谓行动限就是指当天平走出这个值时你需要对过去一天以来的所有数据进行回顾和调查（可以通过偏差调查的方式），以确定哪些检验结果是有效的，哪些数据是无效的。如果你平时不进行日校（总觉得中文用法不科学，因为这并不是校，而是查），那么你根本无法确定当发现问题时这段时间来哪些数据还可用。还有一种所谓的日校也挺可笑的，不过我不记得是否我过去的实验室是否这样做过。就是日校时，首先清零，再外校，再检查。就相当于你把罪证都已经销毁了，再自己查一次，说，“没问题”，那不是自己骗自己吗！不过相信还是比从来都没做过强：前几天去做供应商审计，结果发现人家根本连砝码都没有，还校个屁呀，问他们怎么样算是认为天平有问题，答曰“天平没回到零点”，然后找计量院来看看，也不知道那个计量院来了看出什么没有。
简单举几个仪器设备的OQPQ的例子：
HPLC：泵流速（准确性和波动性）、进样器（重复性和残留量）、紫外检测器（波长准确性、灯能量、噪音和漂移）、多元混合器（梯度准确性和波动性）。
UV：波长准确性、吸收值准确性和重复性、基线平直度、分辨率、噪音和漂移等。
恒温（包括恒湿）箱：不同温度（湿度）分布、准确性和波动性。
灭菌锅：除温度分布外，还有程序升温曲线以及热穿透性。
2、分析方法验证
这部分内容在ICH Q2部分有明确的阐述，但只是在概念上比较清晰，在实践应用中却不是特别明确，我在这里只是对其的实践中需要特别注意的事项作一个补充。
有关物质检测的方法验证具有一定的特殊性，也是最容易被质疑的方法，我想在以后另起章节进行阐述，这里暂不提到，更多的是其他方面的常见问题。
验证的方法与检验方法不一致是最常见的问题！即使CDE和一些药检机构可能也没有注意到这一点，而且由于国内注册中大家都知道的原因造成没有大量数据的积累，进而不会在注册中发现这个问题所造成的巨大影响，以下举几个例子分别说一下：
1）很多国人在制定含量（固体制剂）测定时，都采用研磨后称取的方法制备供试品溶液，甚至在一些口岸所都将进口标准中的投片法给改为研磨法；而在方法验证中即没有采用研磨法，所以看上去验证的结果很美，但你得到的结果却可能是个伪结论，因为很多小规格的产品在研磨过程中都会存在吸附的现象，这种现象会因为不同的人、不同的研磨工具、不同的力度和时间等因素而有所不同，最经典的结果就是经常会发现含量测定的结果要低于均匀度测定的平均值！那么请注意，如果你要采用研磨法制备样品，请在验证时也要将对照品研于空白辅料或样品（加样回收）中，而不是直接投入容量瓶里！如果你要直接投入容量瓶中，只有你的方法是投片法，或者全转移的方法！
2）主成分测定的方法为单点法，而在进行回收率测定时采用的是线性的方法！要知道，单点法本身是一个两点法，另一点就是原点，如果你的线性结果截距远离原点的话，方法就不适于采用单点法，这时你用线性去计算回收率的话，就可能把这种现象给掩盖了。
3）方法采用的是校正因子法，而在验证时采用的是杂质外标法！理由同上一条。
3、分析方法确认
这里单独提出来是因为在新版GMP中提出了这个概念，而在国内官方却没有给出明确的概念，我在这里只是提出一些理念，由于国内没有专业的解释，一些官员就有了发挥余地，所以在检查中有些可能不会被接受，因此你如果不确定的话，最好做验证，没办法，国情如此。
实际上，方法确认是指一个方法对于你的产品（或物料）、实验条件在你实验室能否进行的一种适用性检测。比如说你的工艺与其他人家不同，你的杂质分布也会有可能不同，因此药典的方法不一定能够适合你的产品，所以你要进行确认。至于说你确认哪些项目，在早些版本的美国药典附录1226中有所描述，但由于各家对其理解有所不同，它被认识是最低要求，你要根据自己的情况适当地进行增补，后来在1226中索性就给删除了。
当然并不是所有的药典方法都要做确认，通用的方法是不需要做确认的，例如炽灼残渣、硫酸盐等，一般需要做确认的方法通常是指色谱法，但并不局限于此。
还有一个概念与确认比较相近，叫做方法转移。在我看来，方法转移可以认为是方法确认加上重现性，更重要的是指你实验室的检测结果与原实验室的检测结果是一致的。
4、系统适用性试验（SST）
这一部分是国内很多实验室都不太关注的地方，其实这一部分对于检验是非常关键的。简单的说，你的检验结果是否可信、是否有效、是否有说服力全在这里了。
先说一下SST一般主要考察哪些方面（主要从色谱角度讲）：
1）重复性：检查通过则表明你的系统一直处于稳定的状态里，你的仪器没有问题，如果你的检验结果有问题，要么是你的制备有问题，要么是你的样品有问题，仪器出现问题的机会很小。
重复性国内有相当的企业都在做，但另外一个概念，可以很多企业都不太关注，我将它叫做括号对照品检查，意思是什么呢，你的样品被对照品进样包着，形成一个括号，一个括号没有问题，才表明你的样品检测没有问题，否则你后面的对照品与前面的样品不一致，你怎么保证你的样品在检测时没有问题。在一些要求严格的企业，如果供试品后面没有括号检查，那么可以认为这期间你所有的样品的检测结果都是无效的。
2）分离度考查：这往往是有关物质检测SST最常见的要求（但国内很多标准，尤其是进口注册标准，居然将它转移至含量测定中去，估计连自己都不知道在干什么）。由于国外对于杂质研究的比较透彻，所以它并不会像国内那样去比较供试品和未知杂质的分离情况，更多的是以加标的方法来考查。
3）定量限考查：在一些较先进的方法中，往往规定了配制定量限溶液，以之进样，检测信噪比，要求不得小于10，否则杂质无法准确定量，这往往要优于你在方法验证中所做的用信噪比去筛浓度的作法，因为信噪比会受仪器本身、流动相、电信号、柱子、温度等多方面的影响，甚至有不同数量级的差别，因此后者往往没有任何实际意义。
4）理论板数、拖尾因子等。自己看药典去，根前三个一比，没有值得说的地方。
除了这些，我个人认为以下的内容也可以被认为是SST的一部分，超出规定的范围也被认为是无效数据：
5）平行对照品：如果两份对照品不平行，那么说明你配制过程中可能存在问题，你无法确定哪一个是正确的，因素两份都无效，你也不需要再往下进样，直接重新配制再进样就OK了，对照品无效，那么检验的样品数据也就无效了。
6）平行样品：同平行对照品，两份不平行则说明至少你样品制备有问题，除非你能证明你的方法有问题，既然制备有问题，检验结果当然无效了。如果这时有一个数据为OOS结果，你也大也不必进行调查，因为这是无效数据，OOS只有是在有效数据的情况下再进行调查。例如含量要求98.0%-102.0%，平行要求不得过2.0%，结果是99.0%和102.5%，那么你不需要进行OOS调查；而如果结果是101.0%和102.5%，你就需要进行OOS调查。要记住，你的平行样品的规定是你自己要求的。一般通用原则我将在以后的章节与大家分享。
检验那回事之三——数值修约
提起这个内容，总觉得什么东西在中国就有点怪怪的，真是不明白所谓的“五留双”在检验中有什么意义！仅仅为了好看吗？还是能被2整除？那又如何！费话说了也没有，反正在检验中很少没有使用的地方，遵守就是了，这也叫做中国特色。
在中国的国家标准中把修约说得太文了，还不一定很清楚，我觉得在国外药典中对于其定义非常准确，而且不会有任何歧义——就是将结果按四舍五入的方法，保留成与标准规定相同的小数点位置。简单明了！
由于国标和“红宝书”中有大量的描述有效数字的概念，而且很多人在过去的学习过程中更多的只是学到了有效数字的概念，所以有相当多的人误把结果的修约当成保留成有效数字，这一点一定要注意。更有一些论著规定8和9当成两位有效数字，那么请问目的是什么，在检验中起到什么作用？
不要迷信书，即使是所谓的“红宝书”（下面我可以给大家举例说明其中的荒谬之处，这还只是在数字修约这个章节），当然大家也不要迷信我，重要的是要有自己的思考，再形成理论，而不是某某说了。
“红宝书”里面提到了修约的四则运算，这对我们检验学中是完全不适用的，例如最简单的容量法计算API的含量，有效数字最少的是LOD值，有很多只有一位，例如0.2%，那么按照书中的理论，最终检测结果只能保留一位有效数字，即含量=1乘以10的2次方！
还有人为规定RSD按进一法修约，这也不知道为什么，那么请问，相对偏差怎么修约？含量均匀度怎么修约？标准偏差又怎么修约？而且国内的标准往往对于一些特殊的要求不太注重，例如1和1.0没有区别，<和<=没有区别，那么如果一个国外的标准要求系统适用性重复进样五针峰面积的RSD不得过1.0%，到国内会变成RSD<1%，再按照它的只进不舍的修约方法，则没有合格的时候（总不会有五针峰面积都完全一样的吧）！
有效数字修约中有一个重要的原则，就是不能二次修约，这就要求你在计算的中间过程中至少要多保留1到2位数值，要注意这个数值如果在相同的单位（例如都是百分比）时应为小数点位数，如果是不同单位（例如一个是百分比，另一个是mg/ml），应为有效数字。
举例说明，含量限度为90.0%-110.0%，你在计算浓度时应至少要保留五位有效数字；而在计算到百分比时，至少要保留至小数点后两位。但最好在实际计算时，你使用Ecxel，所有的过程全部使用内置的计算（但你要保证公式没有错误），这样就永远没有二次修约的情况。
提到这里，留个作业，大家可以思考一下，对于一个API含量测定，要求折干，LOD要求不得过1.0%，你认为在含量测定时应至少带入到公式中需保留至小数点后几位。
前几天，我们这里一个同事在做K90的黏度，测流出时间一次又一次，我问什么情况，告诉我说不平行，我一看数据，就差几十秒，告诉我说药典要求怎么怎么样，我说你算算平不平行，几百秒的东西还差在那几十秒秒？
这两天在温习《笑遨江湖》，看到风清扬在教令狐冲剑法时，让他把华山派的几招给连起来，但他连不上，但得知只要顺势划过来就可以了，武功也就大进了。其实检验也是一样的道理，你不要被书本上的条条框框所拘束，只要满足你的检验需求、符合游戏规则就可以了，关键还是要看你的检验目的，这也就是我为什么第一个章节讲的是定性、定量和限量的原因。
检验那回事之四——平行测定
很多人在含量测定时都采用双对照品，大家认为在计算时应该采用A还是B，或者是A和B的平均值，抑或其他，为什么。
要回答就个问题，首先应该说明其目的是什么。采用两份的平均值并不会增加准确性！那为什么要做两份，做三份做五份行不行？当然可以做更多份，只要 你有钱，而且你对于你的操作也非常有信心！
其实做两份在我看来更重要的是用以证明你的称量和配制过程是没有问题的！
任何操作本身就有误差，就如我们前面章节所说的那样，你所用的仪器设备都要确认过的，而且像天平不要做每天检查，但仍然不能避免这各误差，更何况还有可能出现人为误差，而且这些误差并不见得你在操作过程中就可以发现（发现了你就该重新配了）。在你的仪器例如HPLC已经确认完成的基础上，进样平行样品，如果有操作导致的误差可能被发现，当然三份时发现的机会就更大了。简单举个例子，你在称量时出现洒的机率是1%，那么两份一样的机率就是万分之一。
那么我们在计算时应该采用哪个呢，A、B还是平均值？答案其实是都可以，只要检查通过！因为二者都是正确的，而且你也没办法证明哪个更准确，也就不能说明平均值会更好。
为什么要做平行？什么样的检测要做平行？平行的标准又是什么？
前面提到了对照品平行检测的道理，从中可以得出相同的结论：平行不外也是一种检查，以确定你所检测到的结果是没有问题的，当然这也只是必要条件，不是充要条件，前提是方法是没有问题的。举个例子，回收率好的，精密度一定好；精密度好的回收率不一定好！也可以得出结论，两份样品平行，结果不见得是准确的，但不平行一定至少有一个不准确的。
那么有人会问，那我做平行还有什么意义，答案是在你的仪器确认没有问题、方法验证也通过的情况下，如果检测结果是平行的，那么你检测结果的可靠性就会非常高（为什么不说是没有问题的呢，因为就像质量风险一样，是没有消除的，可能是降低；也如同说多数人说得也不一定是对的一样）。
确定了做平行的目的，也就好说什么样的检测要做平行了。
首先，要是你的关键项，你一个炽灼残渣还做什么平行呀！当然如果要是类似于炽灼恒重作为含量的检测，做一下平行还有意义。再有就是可能会影响到你其他检测结果的测定的检测项目，例如LOD限度是NMT 0.5%，你的检测误差（绝对差值）还不至于影响到0.2%，你做平行有什么用，但如果限度是NMT 3.0%，那你检测的误差就可以会比较大，进而会影响到含量测定的结果，就时你就要考虑做LOD的平行了。
其次，定量测定才有做平行的意义，限量、定性检测则完全没有必要了。试想你做个重金属、氯化物还做个平行有屁用，你做个限量远低于报告阈值的杂质检测，你做个平行意义也不大。但如果你对某个指标非常在意，它是你生产要重点控制的，则你首先要考虑将这个方法做成一个定量的，再去平行检测，例如残留溶剂（对于用户则没有必要）。
说来说去，目的才是最关键的，目的决定态度，态度决定一切！
说到平行的标准，我还是那句话，合理的！
什么叫合理的，就是首先你能说服自己，其次你能说服别人，呵呵，费话比较多。
那么什么样才是合理的？
它要满足仪器、方法和人员操作的最基本要求。举个例子，HPLC进样精度限度为0.5%，API含量测定平行的要求为1.0%是可以接受的、制剂含量测定平行的要求为2.0%也是可以接受的；反过来说你的HPLC精度为1.0%，你现在要制剂含量测定的平行要求为1.0%则很难做到。
但也并不是说什么东西都越严越好，一个是你能不能达到，还有就是你有没有必要达到。举两个例子：一是说中国药典还是那个“红宝书”中对于黏度测定不记得是哪种方法要求流出时间应一致。我不知道什么叫一致，我们原来有同事非要做到两个测定连秒秒都相同，弄得从20多个数据中挑出两个，我说你这么做还有什么意义，一个是你在挑数据，二是你自己算一下100多秒的时间差几个秒秒会差百分之几！你折成黏度又差了多少！还最后一位都不带差的，非纠结于这个干嘛。
还有就是有关物质，一般来说，定量限溶液（一般为0.10%）的RSD不低于10.0%。有的方法检测灵敏度比较高，但也没有必要一定要限制在2.0%以下，但如果对照溶液的浓度要高于定量限，你就应该适当的加严RSD的要求，例如5.0%或2.0%等等。
对于平行标准的指标，在国内有很多种，甚至同一称呼也有不同的解释，我个人倾向于三个及以上用RSD，两个用相对偏差或差值，这里所说的相对偏差是指大减小除以平均，意指折算成百分含量时二者的差值；差值就是大减小。在标准有效位数较多时（例如含量测定）采用相对偏差，在标准有效位数较低（例如LOD）采用差值。至于为什么，希望大家能够想一想，然后再告诉我。
检验那回事之五——对照品
首先说明这里所指为化学药对照品（CRS），不包括标准品（BRS）。
检验用对照品可以分为定量用和定性用，还有在国外现在流行的定位用混合对照品，这种对照品既可能是定性的，也有用于定量的。定性的最主要的是用于红外鉴别，还有就是仅用于峰定位，再用校正因子等方法定量计算。
其实分类没有太多内容可讲，大家用过的都知道，这里只是简单的介绍一下，后面用得着的。
其实最重要的是对照品的贮存和使用，还有另一大章节是关于工作对照品的。
对照品一般分为一级和二级对照品，二级对照品是指可以追溯到官方对照品的工作对照品，官方对照品是一级对照品的一种。
如果某一待标品既可以作成一级也可以作成二级工作对照品，那么一般首选按二级工作对照品标定，这是因为：1）标定一级对照品消耗待标品的量大；2）如果你考虑不周全，标定的含量与真实值会相差较大。举个案例，我原来子公司有个小伙子在标定一级工作对照品时，没有按照给的方案要求进行元素分析测定，结果后来某一批样品含量测定结果为115%（不是制剂哟），给我打电话咨询。原来这个东东在合成中会产品相当量的醋酸铵，由于醋酸铵在测纯度、干燥失重和炽灼中均不会检测得到，因此在计算中不会得到扣除，因此这个东东在标定时必须要元素分析合格。这只是个特殊案例，但如果你对合成工艺不了解你就无法预计到这种情况，进而造成检测结果的偏差。
工作对照品标定需要根据用途、用法来确定，即使同一工作对照品使用目的是一样的，由于使用时检测的方法不同，也会有所不同。
工作对照品标定时，如果使用的是API，一般不需要做结构确证，因为你已经用了很多产品的生产了；但如果再精制则至少要做一个IR以确定没有发生变化；如果是一个新的合成路线，或者根本就是杂质对照品，应该进行四大光谱的确证。当然对于杂质来说，纯度不一定要很高，所以你一般不需要做元素分析，但你需要注意你的合成工艺，以避免出现我举的例子的情况出现。
举个二级对照品标定的简单例子：
1）如果你的工作对照品在使用前需要干燥，则你标定时应使用干燥后的样品。
2）如果你的工作对照品是直接使用，则你标定时不能干燥，但对于这种工作对照品，你需要确保其没有吸湿性或风干，而且在保存中对于密封也要特别关注。当然在分装时最好分成一次用量，以避免重复开盖。
3）对于你的系统的要求要更严格，SST中重复性的要求不要超过1.0%，甚至不要超过0.5%。
4）平行样的平行性也要更严格，两份标定结果的差不要超过1.0%，甚至不要超过0.5%。
5）最好要有不同人员的操作，以避免系统误差的产生。
6）要与检测方法相关，例如你标定的方法采用的是API含量测定的方法，使用的是手性条件，如果制剂采用的是非手性条件检测，则此对照品不适用于制剂！反之弈然。
7）这一点也非常重要，如果你的样品为非离子化合物，如果你标定的含量高于100%，则应以100%计，而对于离子化合物则不需遵守本条。
一级对照品标定会更复杂一些，下次再说。
一级对照品标定：
1）一般按照：1-干燥失重-炽灼残渣-有关物质，或者 1-水分-残留溶剂-炽灼残渣-有关物质 计算。
2）你要了解工艺，以避免我在楼上中提高的醋酸铵现象。
3）对于手性的要求，与二级对照品标定中的要求一致，应与使用相符合。如使用手性条件则标定时应扣除手性异构体的含量，否则不需扣除。
4）对于直接使用的对照品，除不得有吸湿性外，应按照上述公式标定；但如果是干燥后使用或同时测定水分的对照品，在标定时应干燥后或扣除水分再标定。
5）如对照品本身就是酸的金属盐，则不得扣除炽灼残渣。不过可以通过炽灼残渣检测本身计算出金属盐含量的正确性。
6）如果只是杂质对照品，由于合成量非常少，在确保合成工艺的前提下，干燥失重和炽灼残渣不是必须的，公式可以简化成 1-有关物质。
7）由于杂质检测和水分（LOD）、残渣的检测虽然相对偏差比较大，但绝对偏差则比较低，多人的标定就不需要必须的，平行测定的要求也不需要那么多。
检验那回事之六——残留溶剂
感受到TXs的热情，打算把本系列内容继续下去，以和大家分享，鉴于之前的内容已/即将全部转移过来，因此现在只是在原来没有写完的第六章的继续，其他部分请看转帖部分。
从此部分之后，所有的内容将从本坛开始首发，其他坛子的内容大家可以不经本人同意转载，但希望能给出ID，毕竟转载者可能不会给他人提出的问题予以解答，呵呵。
书归正书，上回书说到了残留溶剂的来源，这节的内容...
本来想先写有关物质，但计划明年要搞个中级职称，作为论文，不好提前发出来，但通过后再给贴出来，欢迎大家指正。
先写个残留溶剂，这一块内容现在来说也不算新，但国内的要求比较差，无论是官方还是企业都没有引起足够的重视，但有志于学习或国外注册的可以一起来探讨一下。
1、溶剂的来源
按照中国药典的说法，残留溶剂是原辅料生产和制剂生产过程中使用的，而在工艺中未能完全去除的有机溶剂。
这种说法是不全面的，只是残留溶剂的来源之一。实际上，最关键的词应该是“引入”，当然还有一少部分可能是生成的。除了药典中所述的以外，其他的来源下面分别举例说明一下：
1）API合成中使用的原料本身所带来的残留溶剂。
2）API合成中使用的溶剂本身可能含有的，例如甲醇中可能含有乙醇、甲苯中可能含有苯、乙酸乙酯中可能含有乙酸和乙醇等等。
3）酯类中间体在水解反应中可能会生成醇。
还有两类比较可怕的：
4）溶剂多次回收套用可能带来不确定的杂质，甚至没有规定回收溶剂可以用于哪一步生产。
5）运送溶剂的槽车和贮存用桶不是专用进而造成与其他溶剂的交叉污染。
2、标准的制定
大家说ICH和中国药典中有啊，那你可以姑且认之，如果你只是个QC，那么标准不需要你制定，你可以不用Care此部分内容，但我在此部分中要说的是当你是一个API生产企业，你的研发要报一个产品，而此产品残留溶剂又不能符合中国药典附录的要求时你怎么办？还有就是国际注册时你怎么办？
其实，ICH的内容与中国药典附录中所说的是有很大不同的，中国药典只是一个简化了的ICH要求，具体是中国药典对每种溶剂规定了一个限量，要求不得超过这个标准，如果你说那ICH也有这个标准呀，那就是还没有完全理解。
中国药典中规定的各溶剂的量都是百分限量，而在ICH中则规定的是日服用量，二者的差别就是百分量是以日服用量按照10g计算得来的，试想大家吃哪种西药成分日用量在10g或以上的？玄机就在于此！大家可以看到有些API残留溶剂的标准订得超过中国药典的限度，之所以能够批下来甚至列入中国药典，我想原因也是在于此。
那么残留溶剂的最宽松的标准是怎么制定呢？简单的说，三类溶剂日服用剂量不超过50mg，一、二类溶剂的限度按照PDE的量，除以你的日服用量，就可以得出了。这只是最宽松的标准，如果你能满足中国药典的标准，你还是要按照中国药典去申报，否则很难批下来。
那么未列入ICH的残留溶剂品种标准是怎么制定的呢？我不知道现在国家的要求是什么样，但我觉得你首先应查找该溶剂的安全性方面的数据，尤其是有没有潜在的三致的报道，如果有，说明你中奖了，建议你的标准制定为日服用剂量不超过15ug（限度自己去算）；如果没有三致的报道，其他安全性也比较高，那么建议你的标准设定为报告阈值。当然，如果你的产品比较好，你可以采用多批检测结果的X+3S的办法制定上限，但这个标准不要比前面说的高。
那么，什么样的溶剂要订入标准呢，按照国内的要求好像是一类必须订（但前提是使用的，相信现在大家一般也不会“使用”），二类后三步，三类重结晶（偶有年头没做研发了，也不知道现在改没改，欢迎指正）。但对于国外的要求是，你必须能够证明在你的工艺中能够把相应的溶剂除去，否则你就应该订入标准（至于检不检、怎么检后面再说）。
前面说的只是适用于原辅料。
对于制剂产品而言，如果你工艺中所有的要求都能够符合限量值的要求（也就是相当于中国药典的要求），那么你就可以免检；如果其中某种溶剂超过其限度值的要求（也就是说限度比较高），那么你通过计算可以得出，产品的结果仍符合要求（比如说乙腈410ppm），你仍然可以免检；如果通过计算你的产品某种溶剂仍超过限量，比如说以乙醇溶液作为润湿剂的湿法制粒工艺所生产出的产品，那么你只有通过检测才能证明的产品是否符合要求。当然这个标准只能是中国药典或PDE的标准。
检验那回事之七——有关物质
原料药中的杂质包括有机杂质（工艺和药物相关的）、无机杂质和残留溶剂。其中有机杂质就是一般我们所指的有关物质，是指在药物生产过程/贮存中所引入/生成的起始物料、中间体、副产物、异构体、降解物、催化剂等1；药物制剂的有关物质主要是指药物自身的降解物以及药物与辅料或包装材料相容性产物等2。有关物质可能会具有不确定的毒性，甚至潜在的致癌、致畸、致突变等性质，因此需严格控制。
国内外药典中很多品种有关物质检测方法通过峰面积比较的方法来确定是否符合规定，这种方法忽略了供试品溶液和对照品溶液的实际浓度，是一种限量检测的方法。但这种限量方法有相当的局限性：一是忽略了实际浓度会导致测定数据的准确性降低，二是无法统计出有关物质的稳定性变化趋势和样品的批间差异。越来越明显的趋势表明，国外更多的品种正以定量的检验方法来代替限量的检验方法，本文的目的就是以定量的方法来说明有关物质检验方法的建立、验证和检验的要求。
由于药物和有关物质本身一般都是有机物，且具有相类似的化学结构，因此具有专属性（稳定性指示性）和准确性高的HPLC法就作为了有关物质检验的首选方法。本文将针对HPLC法检验有关物质方法的建立、验证和检验与大家作一个探讨。
一、有关物质检验方法的建立
首先需要说明的是，任何一种检验方法都不可能是万能的，HPLC法也是一样，一般有两个大的缺陷：一是HPLC检验的图谱不是一个“全谱”，也就是说一个HPLC方法并不会像TLC方法一样把所有的杂质都会同时检验出来，尤其是国内现在使用较多的恒流的色谱方法，极性相差较大的化合物很难在一个色谱条件下检出；二是有一些杂质在检验条件下没有响应，例如一些化合物的原料/中间体/副产物没有紫外吸收，使用紫外检验器是无法检验到的。因此在建立有关物质的检验方法时，往往需要针对不同的已知杂质建立特定的检验方法，作为有关物质检验方法的补充，这个方法即可能是HPLC法，也可能是TLC法，甚至可能是紫外法或滴定法等等，需要说明的是，对于此类杂质在总杂质计算中不应被重复计算。
有关物质HPLC检验方法在建立时需考虑到在该色谱条件下是否所有潜在的杂质都能被检出、各杂质的响应值是否合适、有关物质与含量之间的质量守衡（Mass Balance，即理论上含量降低多少有关物质就应该增加多少）。
很多人在有关物质检验方法建立时参考的是含量测定的方法甚至是血药浓度测定的方法，往往这是不合适的，因为这些方法都是针对主成分的测定方法，它不会去考虑杂质的检出情况和准确性，只需要不干扰主成分的测定即可，而且往往在含量测定的浓度下杂质不能够检出，因此无论是流动相的组成还是检验波长，可能都不适合有关物质的测定。
由于制剂有关物质的检验重点是降解物和相容性产物，因此原料药生产工艺杂质（包括原料、中间体、副产物等），如果不是降解物的话，都不是制剂有关物质重点关注的内容，在制剂质量标准中甚至可以不订入2。因此制剂有关物质的检验方法很可能与原料药会有所不同，这时需对原料药中可能存在的工艺杂质进行重新定位，这也是方法建立和专属性验证的一部分。
有关物质HPLC检验方法的建立主要有四个关键点：色谱柱的选择、流动相的组成、检验条件的选择、杂质测定的方法。下面我将从这四点出发说明有关物质是如何建立的。
1、色谱柱的选择
根据主成分和杂质的化学性质，选择合适的色谱柱，使其能够尽可能在一个色谱条件下检验所有杂质。在选择时往往极性强化合物选择极性色谱柱、极性弱的化合物选择非极性色谱柱，但由于成本和环保的原因，除极性非常强的化合物外（例如糖），一般我们首选非极性色谱柱（例如C18）。
即使相同类型的色谱柱，由于品牌、规格、型号等差异，色谱柱的保留行为可能会有很大差异，因此在检验时应尽可能固定这些参数。
2、流动相的组成
流动相的组成往往取决于色谱柱的选择，在色谱柱选定后，通过调节流动相中各组分的比例、pH值、缓冲盐（包括离子对）的种类/浓度等条件，使主成分和杂质能够分离并在一个条件下检验，必要时应使用梯度。
缓冲盐，特别是离子对试剂，各厂家的质量差别比较大，因此在使用时应尽可能使用固定的可靠的品牌。
3、检验条件的选择
选择合适的检验器是有关物质检验的一个重点，各种类型的检验器都有各自的优缺点。例如紫外检验器的优点是成本低、适用性广、操作简单，缺点是紫检验器为非质量型，各杂质和主成分的响应值可能会差别非常大；而蒸发光散射检验器的优点为它是质量型检验器，各杂质与主成分的响应值比较接近，缺点是价格比较高、非挥发性流动相不能使用、检验结果非线性。
作为最通用的紫外检验器，有关物质检验波长的选择非常关键，这一方面决定了是否所有潜在杂质能够检出，同时也决定了检验时是否可以采用主成分对照的方法测定（本文中所说的对照既可指主成分对照品，也可指主成分自身对照）。
4、杂质测定的方法
通常只有校正因子在0.9～1.1时才可以使用主成分对照的方法（国外由于有关物质标准制定得比较严格，所以校正因子在0.8～1.2时仍可以使用主成分对照的方法），校正因子超过此范围的杂质应选择外标法或校正因子的方法测定。
校正因子一般是通过同时进行杂质和主成分的线性测定（线性浓度范围通常是从报告阈值或定量限到杂质限度或对照浓度的120%～150%），再用主成分的斜率除以杂质的斜率而得出，在计算时将杂质峰面积与校正因子相乘即可。校正因子的概念与EP中的概念相同，与USP中的相对响应因子互为倒数，因此在使用中一定要注意。
二、有关物质检验方法的验证
根据对药典的理解，相当大多数的研发人员和检验人员认为有关物质检验方法应该是一个限量检验方法，验证可以按照限量的方法进行。但这种理解是不合适的，我从以下几个方面来论述有关物质（最起码是限度超过报告阈值的有关物质）应按定量方式进行验证和检验的：
A、对于外标的检验方法例如含量，样品称量要求“精密称定”，以代入浓度进行计算；限量法只需要“称取”一定范围内的样品即可，因为称量结果并不代入计算，也就是说样品的称量范围控制在较小的范围内（不是百分之十），只要在范围内，实际称量值已不影响检测结果。在有关物质检验中，往往要求供试品和对照品称量“精密称定”。
B、从趋势分析的角度来说，采用限量法无法对稳定性结果和年度质量回顾进行杂质的趋势统计和分析。
C、ICH Q3A和Q3B两部分均有描述，定量限不得高于报告阈值，即需要报告的杂质具备定量的条件。
D、ICH Q3A和Q3B两部分对于杂质的描述，对于数据的最终报告，均采用数据的方式，应为定量计算而得出的。
E、USP3等国外药典中要求未知杂质的限度为不得过0.1%，ICH Q3A和Q3B也要求超过鉴定阈值（一般为0.10%）的杂质必须鉴定，检验时必须采取先修约后判定，这是限量法所不需要的。
F、USP4和EP5附录中对于有关物质的积分、计算和报告，也说明了其检验方法应为定量的。
综上所述，有关物质检验宜采用定量测定的方法，对应的方案验证也应采用定量的方法（限度低于报告阈值的杂质可采用限量测定/验证），即最少需要进行专属性、准确性、精密度、定量限、线性/范围、耐受性等几方面的验证6，同时需进行系统适用性的考查。下面我从验证的几大模块分别阐述有关物质检验方法的验证要求。
1、专属性
专属性最主要的要求就是溶剂、主成分和辅料等对杂质检验没有干扰。
对于溶剂干扰主要为在溶剂峰位置与潜在杂质峰是否重叠，以及溶剂峰是否影响杂质峰的正常积分。
对于主成分干扰，需要考查已知杂质和强制降解峰是否与主峰重叠，一般需要采用二极管阵列检验器证明主成分峰的纯度。除了峰纯度外，在强制降解试验中，需要考查质量平衡，即在主成分含量降低约10%～20%情况下，含量降低值与有关物质绝对增加值的偏差不超过5%，否则说明有关物质的检验方法不适用，有些杂质未检出，或者有些杂质的校正因子不准确。
对于辅料干扰，需要考查已知杂质/降解物峰与辅料峰能够识别并充分分离，以确保杂质能够完全、准确的检验。这里需要说明的是，“把辅料峰算成杂质峰也是合格的”这种理论是完全不对的，辅料峰是不能被计入杂质峰的，因为杂质是被要求准确、定量的。
对于原辅料有关物质检测，必要时应使用成品有关物质的检验方法进行中间体粗品的考查，以确定中间体的杂质在主成分中残留的情况。
2、准确性
由于有关物质相对浓度较低，因此对于准确性要求也并不像含量测定要求那样高，但也有其特殊性，即回收率计算方法应与检验方法一致。也就是说，如果检验方法规定为外标法，则回收率计算时应采用外标法；如果检验方法规定为校正因子法，则回收率计算时应采用校正因子法；如果检验方法规定为主成分对照法，则回收率计算时应采用主成分对照法。否则一概采用外标法计算是没有任何意义的！
有关物质准确性验证一般采用加样回收法，分别验证报告阈值、限度值和限度值120%～150%三个浓度水平下的回收率。在试验时，分别配制相应的对照溶液、供试品溶液和三个杂质浓度水平的加标供试品溶液，计算时分别测定供试品加标前后特定杂质的量，扣除供试品中含有的杂质的量，计算回收率。
一般在报告阈值水平，回收率可接受标准为80%～120%；0.5%～1.0%含量水平的杂质，回收率可接受标准为95.0%～105.0%。
3、精密度
由于供试品中的杂质种类、数目和含量，与工艺和批间差异有很大影响，因此对于超过报告阈值的杂质，精密度验证可以通过配制多份平行样品进行测定；而对于供试品中不含/含量低于报告阈值的杂质，可以通过计算不同浓度水平回收率的RSD来得出。
精密度验证时，测定方法同样应按照规定的方法进行。
4、定量限和检出限
按照ICH Q2的要求，定量限和检验限一般有三种测定方法，但在实际HPLC方法中应用最多的是信噪比法，即定量限为信噪比10:1、检验限为信噪比2～3:1时被测物的进样量。但在实际中往往这种测定方式是没有意义的，因为信噪比决定于被测物的峰高和噪音的波动大小，不同的仪器、峰保留时间、仪器状态、流动相配制、甚至室温，都可能会严重影响信噪比的测定结果，甚至可能是不同数量级的差别7，因此定量限/检验限不应只在验证时进行，在检验中同样也需要进行确认，并作为系统适用性试验的一部分，以保证检验结果的准确性。
如果说这种定量限/检验限的验证方法不适合，那么怎么样去进行定量限的验证呢？根据ICH Q3A和Q3B的要求，定量限不得高于报告阈值，因此我们通常按照报告阈值相对浓度配制成相应的对照品溶液，在进样检验，要求其信噪比不得低于10:1（对于限量检验，要求按照限度值配制的对照品溶液的信噪比不得低于3:1）。这种溶液同样在有关物质检验中也应当考查，如果信噪比没有通过，则系统适用性试验没有通过，需要通过更换流动相/色谱柱/色谱仪等方法来解决。
定量限及以上的杂质可以定量检验，因此定量限验证除需满足信噪比的要求外，还应满足重复性的要求，一般连续进样六针，其峰面积的RSD不得过10%。
5、线性/范围
一般至少五个点，从定量限到限度值的120%～150%，上限不宜过高，否则线性斜率会发生漂移，相关系数至少为0.99，面积归一化法至少为0.999。如果定量限和限度值150%回收率通过，可不必考查Y轴截距与斜率的比值。
6、耐受性
有关物质一般不宜做较大范围的变化，尤其是梯度的方法，可重点关注相同规格不同品牌的色谱柱之间的耐受性，其他例如流动相比例±2%、pH±0.1、柱温±5℃也需要关注。
在耐受性试验中需要考查不同条件下主要杂质的数目、相对保留时间和检验结果是否可以接受，也要考查系统适用性试验是否能够通过。
溶液稳定性也可以作为耐受性的一部分，这里既需要考查供试品溶液的稳定性，也需要考查对照溶液的稳定性。溶液稳定性是检验结果是否有效的基本依据，也会实验室调查提供了可能。对于有光敏感的样品必要时也应考查光稳定性。
7、系统适用性试验
系统适用性试验是色谱检验的最基本要求，如果没有通过表明系统没有能够达到检验的要求，所产生的数据也是无效的。
有关物质检验中最常见的系统适用性试验一般为重复性和分离度考查。重复性一般是通过连续进样对照溶液/系统适用性溶液（一般为五针或六针），计算峰面积的RSD得出的，一般0.1%杂质溶液的RSD不得过10%、0.5%～1.0%杂质溶液的RSD不得过5.0%、1.0%以上杂质溶液的RSD不得过2.0%；由于国外对杂质研究得比较细，往往分离度测定是通过配制专门含有特定杂质的对照品溶液/系统适用性溶液/分离度溶液，再进样检验完成的，而国内由于对杂质研究比较粗，往往是通过观察供试品溶液的图谱来完成的。
好的系统适用性试验，除分离度和重复性检测外，还包括每次的定量限溶液测定，即配制的定量限溶液的信噪比应不低于10:1。
三、有关物质检验方法的检验
通过以上内容，可以得出结论：有关物质检验宜定量检验。因此在检验中需要注意以下几个方法的内容：
1、系统适用性要求
同以上验证部分的相关要求。
2、最小峰面积的设定
在一些药典或标准中有这样的描述：“小于对照品溶液主峰面积0.5倍的忽略不计”，这实际上是指杂质的报告阈值，而并不能当作最小峰面积。因为杂质检测是定量测定的，检测结果是通过计算后再修约得到的，如果按照此峰面积设置最小峰面积，则有一部分峰面积略小于设定值的杂质不会被积出，进而造成漏检，例如最小峰面积设定为100，则峰面积为99的杂质不会被积出，但二者的计算结果可能都是0.05%。那么是不是最小峰面积设置得越小甚至是0才好呢？也不是，这样会造成非常小的峰甚至小于检测限的峰也被积出，影响最终的计算。参考EP和最新的USP对于色谱法测定有关物质的要求，最小峰面积一般设置为不超过报告阈值的一半4,5，但在最终结果的报告中，只有超过报告阈值的杂质才被报告和计入总杂质。这也是同一份样品在不同实验室中的检测结果可能存在巨大差别的重要原因。
而对于有杂质采用校正因子法测定的方法时，也应适当设置降低最小峰面积，以保证略小于报告阈值的杂质能够得以正常积分、计算、修约甚至报告。
3、与主峰不能完全分离杂质的积分
在很多检验中会有主峰与杂质峰不能完全分离的情况，这时积分就非常重要了，一般系统默认的方法都是将相邻峰沿谷底进行垂直分割，这样会造成杂质峰内含有大量的主成分在里面，这时应采用谷-谷积分（或者采用切线积分）4,5的方式进行积分，以保证杂质峰内不包含主成分，而由于主万分浓度远大于杂质，因此也可以确保积分后剩余的三角形中不包含杂质（切线积分下面没有三角形，三角形面积均计入主成分），进而计算出准确的检测结果。
但需要注意的是，两个杂质峰没有完全分离的话是不能采用谷-谷积分的，否则下面的三角形面积将被漏检，这时应根据实际情况决定采用垂直积分或者切线积分的方式。
4、有关物质单个杂质的计算
采用自身对照法比较简单，直接用供试品溶液杂质峰面积除以对照溶液主峰面积，再除以对照溶液的稀释倍数即可；而对于采用外标法或主成分对照品法时，需要分别计算对照品溶液的浓度和供试品溶液的理论浓度，其中供试品溶液理论浓度的应考虑供试品的含量，尤其对于不稳定的制剂产品。
为便于申报数据的统计、稳定性和趋势分析的要求，一般可以将有关物质计算的结果进行修约（用于放行检验的可以按照质量标准的小数点位数进行修约）：对于原辅料结果小于1的应保留至2位小数，对于结果大于1的应保留至1位小数1；对于制剂产品结果小于1的应保留至与报告阈值相同的小数点位数，结果大于1的应保留至1位小数2。
将修约之后的结果与报告阈值进行比较，如果结果大于报告阈值，应报告实际修约结果；如果小于报告阈值，则可以报告“小于***（报告阈值/定量限的数值）”。对于一些特定杂质，峰面积小到未被积分时，可以报告“小于***（检测限的数值）”/“未检出（检出限为***）”。
5、有关物质总杂质的计算
有关物质总杂质不应该采用总峰面积，按照单个杂质的计算公式进行计算，因为这样会将小于报告阈值的杂质也同时计算在内，造成结果的不准确。总杂质在计算时，应将所有规定内的各超过报告阈值的杂质相加得出。
6、有关物质的统计
有关物质在检验时，应尽可能地保证使用相同品牌、填料和规格的色谱柱，甚至相同品牌的仪器和试剂，以保证各杂质峰位置的一致性。在有关物质报告时，应同时报告各杂质的相对保留时间，一般相对保留时间2.0以内的杂质可以确定至小数点后一位，2.0以上的杂质会由于系统的漂移最好规定一定的范围。在稳定性和年度质量回顾时对于有关物质的统计应基于相对保留时间分别对单一杂质和总杂质进行统计.
检验那回事之八——水分测定
好久没写了，一直没想好什么专题，个人觉得专题必须是应用广泛的，而且是比较基础的，这样才容易被人所接受。希望这不是收笔之作。
水分测定是药品生产和检验检验中最常应用的一种技术，中国药典附录上把干燥失重给单列出来，因此水分测定法中只规定了两种方法，卡氏法和甲苯法。实际上我们常用的方法有四种：干燥法、卡氏法、甲苯法（蒸馏法）和气相色谱法（使用电导检测器）。由于甲苯法和气相色谱法应用比较少，且操作没有太多的注意事项，所以不作为本章的考虑内容（当然还有一种叫做热重分析法，这种方法更不常用，有兴趣的可以交流一下）。
干燥失重是我们在药品生产和检验中最常用的方法，其中在实验室中最常使用的干燥箱、减压干燥箱和减压干燥器；在生产中最常用的是红外/卤素水分测定仪。
由于干燥失重本身是一种非专属性方法，它既可以检测水分，同时样品中的残留溶剂（简称RS）也会“干扰”水分测定的结果，即简单地说，干燥失重=水分+残留溶剂，所以我在对照品标定的章节中说，一级对照品的含量=色谱纯度-干燥失重-炽灼残渣（也可以将色谱纯度改成100-有关物质），或者一级对照品的含量=色谱纯度-水分-残留溶剂-炽灼残渣。
所以，在欧美，如果产品中没有一、二类溶剂的话，其三类溶剂的检测可以使用干燥失重的方法来测量，当然前提是LOD NMT 0.5%，因为这个限度是三类溶剂的可接受标准，这时不需要区分0.5%的标准是来源于水分还是来源于RS，这只是一项符合性检查。但对于生产企业来说，还是强烈建议采用专属性方法检测RS而不是LOD，毕竟你要对你的产品要有足够的了解（这个内容本应该在残留溶剂章节中讲述，但由于比较冷清所以这一章节没有写完，需要的话以后继续写）。
当然所有东西都有前提，检验也是一样，LOD能代替水分检测的前提就是：1）RS基本无干扰；2）样品比较稳定，不至于干燥过程中发生分解产生挥发性物质；3）样品中水分能够充分挥发出来。前两条好理解，第三条网上也总有人不太明白，给我发帖问。其实也比较简单，很多化合物，本身结构中就可能带有结晶水，例如初中化学就有蓝色的五水合硫酸铜，失去全部结晶水变成无水硫酸铜后，就变成了白色的了。那么大家就知道了，有个结晶水这么个概念，而且结晶水对于同一个化合物（理论上含不同结晶水的化合物就不能叫同一化合物了，但为了好理解，此处仍称之为同一化合物）来说可能还有不同的数量。所谓结晶水，你可以认为是化合物结构中的一部分，所以要想除去它是相对比较困难的，当然这也和化合物本身有关，有的容易些有的难些，甚至有的化合物在不同的温度下呈现不同的结晶水含量，例如五水合硫酸铜失水-温度曲线呈现楼梯状。那么也就是说，一个化合物在测定LOD时，有可能测定的结果只是游离水，也有可能是总水（当然像硫酸铜那样失去部分结晶水在药品检验中是没有意义的），在你研发制定方法时，就需要考虑你到底是要什么样的干燥结果，必要时应使用卡氏水分测定的方法来确定干燥后的水分是什么样的，含结晶水、不含结晶水、还是还部分结晶水，当然简化处理的方法就是不制定LOD标准，而制定卡氏水分标准。
需要注意的是，对于含量测定，LOD有时也是很重要的，从API来说看起来比较简单，分母带个“1-LOD”，这是因为往往API含量测定的标的物就是API本身或无水物，而对于制剂来说就稍显复杂了，前两天有网友给我留言，就不明白到底是怎么回事了。大家知道，很多药品，含量测定的标的物并不是API本身，有些化合物分子中既含有盐（例如盐酸****）又含有结晶水，而制剂标的物可能是含水的、可能是不含水的、还可能是既不含水也不含盐的，而此时对照品在使用时又恰恰要求进行干燥处理，那么你这时就必须要知道，在干燥处理的条件下得到的对照品到底是含还是不含结晶水的，因为这将涉及到含量计算时分子量系数的折算问题，这个折算可能既涉及到水又涉及到盐。当然这可能也说明中国药典或标准中说明得不够详细，印象中在USP中的品种都有明确的两个分子量用于计算的。
那么LOD测定方法的关键因素是什么呢，简单地说就是温度和真空度，对于减压干燥而言，真空度我们是特定的，所以真正的关键因素就是温度，温度与产品的结合就是你最终能够得到的结果。一般来说，对于没有结晶水的化合物，105℃是可以保证游离水的测定的，但对于含结晶水的化合物来说就不好说了，你可以通过TG（热重分析）和/或卡氏水分来确定。
谈到LOD测定，除非方法以外，还要注意所使用的仪器/设备（简单地说，能直接出数据的叫仪器，辅助性的叫设备）必须经过确认，确认的关键就是温度，对于大型的恒温箱来说，需要做温场分布，对于热天平之类的仪器，还要做天平的确认（包括日校，当然由于数据量不是太大，周校/月校也是可以接受的）。需要注意的是，有些设备并不是空气循环加热的，而是采用加热板加热的，这时的温场分布就不能考虑箱的整体了，而只能考虑加热板的一个平面了。 下面说一下卡氏水分测定。
卡氏水分测定的基本原理是，在有二氧化硫和弱碱性化合物存在的情况下，水分子可以与碘分子定量地发生反应，通过测定反应所消耗的碘的量就可以计算出样品中水分的含量了。
那么，构成卡氏滴定就需要有四种试剂：二氧化硫、弱碱、溶剂和碘。弱碱早期使用的是吡啶，由于其有恶臭，所以现在一般使用的主要是咪唑；溶剂最常用的是无水甲醇，可能最主要的原因是甲醇成本较低，且对大多数有机化合物具有较好的溶解性，因此被广泛应用，但其在有些情况下也有缺点而不能使用，这我将会在后面进行描述；而根据碘的来源不同，卡氏滴定又可以分为两种，一种是容量法，用于测定常量水分（一般认为5mg以上的含水量），此时碘的来源是将碘配制成滴定液，采用直接滴定的方法测定水分的含量；另一种是库仑法，库仑法是没有碘滴定液的，碘分子是通过将电解碘化钾产生的，在测定水分时，当电解液中有水存在时，电极可能检测到电位差，进而产生电流，将碘离子电解成碘分子，用于与水发生化学反应，当水被消耗光时，不再产生电流，也就没有碘分子生成了，仪器通过测定所消耗电量来计算样品中的含水量的，库仑法被认为是微量水分测定方法（一般认为5mg以下的含水量）。
在USP中，卡氏水分测定被列入到<921>中，其中容量法是Ia，库仑法是Ic，在早期的版本中，Ic一节中试剂一项中写的是见Ia。我在08还是09年曾经给USP写过一封信，明确指出这是错误的，虽然没有得到回复，但之后的版本Ic这一章节就被修订了。
下面介绍一下，卡氏水分滴定所要注意的事项：
1、 对于容量滴定来说，由于滴定液是有机溶剂，存在易挥发和易吸水的情况，因此每次使用时应临用新标，包括更换新的一瓶滴定液时，要将整个管路进行润洗后再重新标定。当然，为了节省滴定液，你可以将开始一部分不外之后将管路末端插入滴定液瓶中打循环（当然不建议这样做，毕竟这可能会对检测结果带来风险）。库仑法不需要标定，因为它没有滴定液，但应定期进行确认。
2、 空白干扰。虽然滴定要求是在密闭的容器内进行的，但这种密闭性不是绝对的，即使在环境条件比较稳定的情况下，仍会有水分透过密闭系统进入滴定体系中。这时就要求我们在滴定时扣除这种“空白”带来的干扰。具体操作就是，在滴定系统平衡后，测定一段时间的漂移值，用以计算每分钟平均带来的干扰，再在样品滴定时计算进去（水分量减去平均每分钟漂移值与滴定时间的积）。要注意的是，由于样品在溶剂中溶解需要一定的时间，而这个时间对于有的样品来说甚至比滴定还慢，所以建议你的滴定方法中将样品溶解时间设定在滴定之前，换句话说，你设定一个混合时间（例如1分钟或2分钟，根据样品的溶解性来确定），再进行滴定，以确保滴定结果的重复性和准确性。另外，对于滴定终点的设定也是一个重要的内容，有时药物可能会存在一些反应较慢的副反应（较慢的方法就不适合了，下面会提到）造成滴定后期漂移值较高降不下来，这时你就要考虑设置一个较高漂移值的终止参数或较短的终止时间了，否则可能会造成检测结果偏高，当然其他的方法后面我也会提到。
3、 确认与标定：在实践中，大家往往使用纯化水进行滴定液的标定，但使用纯化水标定有一个缺陷，就是称样量太小（一般为10-20mg），而使用十万分之一天平往往达不到USP最小称量的要求（国内即使能达到误差也可能比较大）。实际上，国际上通用的水标准物除了纯化水以外还有两种，一种是市售的标准水（你自己也可以配制，标定和稳定性研究后自己使用，如同工作对照品，但要密封保存，开封后当次使用），例如1mg/ml，这时你标定时甚至可以使用移液管去定量移取；另一种是二水合酒石酸钠，你可以买带证书的水标定专用试剂，这种试剂水含量好像是15.66%，这样就可以加大称样量以满足天平的要求，但这种试剂有个缺点，就是在甲醇中的溶解性较低，所以在仪器确认时要注意经常更换溶剂。另外，前面说过由于库仑法不需要进行标定，所以在使用时要经常使用标准水对仪器的准确性进行确认（使用不多的可以考虑每月/季确认一次）。仪器确认时要考虑准确性、精密度和线性，尤其是要考虑最小含水量的准确性，必要时可以考虑检测时降低滴定液的浓度。
4、 缓冲体系：由于反应要求是在一个弱碱性条件下进行，较大量的强酸或强碱性药物可能都会影响滴定的进行，因素对于这类药物如采用卡氏水分测定，在方法建立时必考虑在溶剂体系中加入相应的缓冲剂以对抗药物本身对检测的影响。当然还有另外的方法将在下面说明。
5、 副反应：这是卡氏水分滴定的重关键的一环，简单地说，就是：1）凡是与碘可能发生化学反应的，包括氧化还原或络合，典型的如一些强还原剂；2）凡是与溶剂发生反应生成水的。第一种情况，包括上面据说的其他解决方案，就是将水分仪与小烘箱相连，烘箱加热所产生的水和溶剂通过导管转移到滴定杯中进行滴定。对于第二种情况，最典型的就是醛酮化合物，由于它可以与醇发生缩合反应而脱水，进而导致检测结果偏高。这种情况，一般来说解决的方案是使用醛酮专用滴定液和溶剂，最主要的是更换掉溶剂中的甲醇，当然它的缺点之一就是溶解性下降和成本提高。
当然我过去以往的经历还遇到过将样品溶解后转移至滴定杯中测定水分含量（USP Ic早期的方法），结果由于样品的水分含量较低，而空白溶剂本身的总含水量可能要大于样品，所以会造成检测结果误差较大，这我在那次投诉中也有提到，当然现在的USP Ic法好像没有要求必须先溶解后再取样测定了。
至于说市售什么单组分、双组分等，不外就是二氧化硫加在哪里，这里就不再多说了。
还有就是一个小技巧，如果你们当地湿度比较高或者溶剂保存不好时，会造成溶剂含水量较高，这时仪器预滴定可能会消耗较大量的滴定液，你可以事先准备点碘或碘甲醇溶液，如溶剂含水量较高时可以在滴定杯中加一些，要注意不要加多，以节省滴定液的消耗量，当然如果加多了，可以再加一些水，就跟和面一样J。
检验那回事之九——影响溶出度/释放度测定结果的因素
世界杯结束了，还是没班上，在家闲得难受，想来想去，再写点东西吧，写什么呢，可能没写的比较大的一块就是溶出度了。但想想现在网上东西也比较多，什么一致性呀、方法建立呀，都已经成套的东西了，写出来可能就会让人感觉是抄的，算了吧，还是写点别人不常写的（没准之前写了很多的人很少做实验，当然我也很少做，不过我喜欢安排人做，我总结），希望能够给一线的操作人员提供一些参考，而不是“我设计了一套方案，你们去做吧”，一方面是死也死得明白，没准还可以重生。
这次的主题是关于在溶出度/释放度检测中可能出现的问题，以提供检验人员调查之用，至于说方法建立/一致性之类的，如果感兴趣，后面可以讨论，这将不作为正文的主要内容。
由于经历所限，本文所指的方法主要是桨法和篮法（小杯法是中国独创，意义不大，没准哪天又被删了，但可以参考上述二法），USP中其他的一堆方法就不要往里套了。
1、仪器因素（这里针对溶出仪）
把这一部分放在最前面，是因为仪器是我们的工具，它性能的好坏直接决定着检测结果是否准确可靠，并且能够在实验室间重现。
1）是否使用对了合适的装置，这个内容看起来简单，但实际上对于溶出仪来说，除了装置I和装置II以外，还有沉降蓝一说，如果该使用而没使用的话，样品漂浮起来可不是盖的，你本来缓释的可就变成了速释的了。
2）桨板和转篮的规格，这个大家说有什么问题，不是标准配置吗，但大家可以对比一下国内外的规格范围，没准会在其中发现什么秘密，有没有影响有多少影响不好说，但如果不同仪器不重现的话这可能也是调查的内容之一。
3）桨杆的垂直度、晃动度和振动，这不用说了，任何偏离都可能带来测定结果的变化，这些项目应定期确认，建议不超过半年（所有都做了实际校正片意义不大）。需要特别注意的是，如果可能的话，建议每台仪器、每个位置固定使用同一个杯子、杆/桨，也就是要编好号，对号入座，这是非常必要的，俗话说脚正也怕鞋歪，你确认通过了使用时换了位置，没准就会有问题。
4）转速，这也不用太说，发现问题最早要排除的对象之一，但需要注意的是，同一台仪器不同杯之间的速度并不一定都是相同的，有可能只是其中一两个位置有问题，所以你要确定每杯中的转速都是符合要求的。
5）介质温度，这里要说明的是介质温度与水浴温度可能是不同的，可能会滞后一些，所以下样时一定要注意各杯中介质的温度都要稳定了，如果可能的话，要有持续监测介质温度的探头以确保在溶出（尤其是释放）过程中介质的温度没有问题。
2、样品因素
确定是否是样品问题，往往同步进行对照样品（经检验符合要求的样品）的检测，比如四杯“问题”样品，四杯留样，同一台溶出仪/HPLC检测，观察现象（包括崩解时间），当二者没有明显差别时，那很有可能不是溶出/样品的问题，很有可能是检测的问题（例如HPLC、对照品等，当然也不能排除低溶解度样品由于粒度大小不同而造成溶解性差异等情况，这个不是绝对的，需要后续调查）；而有的样品可能会出现不崩解或者漂浮甚至样品不溶解（而对照样品没有），这时就基本可以判定是样品的问题，要么是生产的问题要么是稳定性问题。
当然我在蒲公英上也举过一个OOS调查的例子（https://www.ouryao.com/thread-240448-1-1.html），恰恰是样品外观上看起来细粉略多一些，但调查结果证明了OOS正是由于样品问题引起的。
3、检验方法方面
这里要从两个大方向来说，一是检验，也就是溶出仪的角度；二是检测，也就是HPLC/UV等。
1）检验
A、取样位置，这方面问题比较小，但要注意的是使用自动取样装置时，如果介质量比较少（例如500ml）的话，由于在线过滤器的原因可能很难保证取样头在桨/篮水平面与介质水平面中间，所以这时可能要做出点牺牲，当然牺牲的不应该是取样位置。
B、样品过滤吸附，药典的方法一般都是取样之后过滤，取续滤液检测或稀释，但此时由于取样量比较少，有的人为了好滤还使用直径比较大的滤膜（例如ɸ25的），此时就会存在样品被吸附的可能性，尤其是对于小规格制剂。所以有两种方案可供选择，一是选择离心法（当然这一般不是药典规定的方法），另一种方法就是要筛选合适的滤过体积，需要注意的是，在针对不同厂家、不同规格、不同材质的膜进行验证，而且对于筛选出来的也不是仅以一个滤膜的结果来说明，因确保多膜均能保证。筛选时可以使用同浓度同介质的对照品溶液进行。筛选好的厂家规格和材质应写入相应品种的SOP中。
C、滤器干扰，这也包括滤膜和在线滤头。由于国产玻璃仪器的质量比较差，现在很多检验员在溶出过滤时采用的是密封性较好的一次性塑料注射器，我就分别遇到过注射器和在线滤头干扰的例子，也就是说由于滤器中有化学成分的残留，进而导致在过滤过程中滤到样品中去，而在样品检测时恰恰又被检出（可能与主峰分离，但这种情况仍需调查），开始的时候调查过两三支注射器没发现问题，调查了一大圈，又回来做大量的调查，结果发现有的注射器有残留，有的没有，检测中发现的正好有，初始调查时正好没有，所以你在使用某家滤器如果发现有这种情况，即使不干扰你测定，你也要写做SOP中，说明在RRT多少多少处的色谱峰为某某滤器的残留（必要时附图谱）。
除了这些情况，还遇到过溶出介质的量加错了的时候，不过还没检测就发现了，但提醒大家要注意的是，在检测结果没有出来之前，不要轻易把样品溶液全部给倒掉和清洁了，否则这种情况可能死都发现不了。
2）检测
可能对于HPLC来说，重要的是介质/残留物等不干扰测定，对照品溶液配错了这里就不要放在这里说了，下面重点讲UV法。
作为溶出度检测最重要的检测方法之一，UV具有成本低、速度快等特点，当然其最大的缺点是专属性差和线性范围窄。我前家单位有一个控释品种，也不知道是哪个“专家”批的，紫外线性法，关键的是首个释放度紫外值大概不到0.02，最后一个时间点大概在0.1左右。有人说，那你不会用长池吗，用长池紫外值不就大了吗！但客观存在时，如果有干扰，干扰也会随着池长度的增加而增加，比例不变。我刚到公司在检测过程中，甚至有人汇报给我，说首个时间点检测结果为负的。我说这怎么可能，你用的是同一批溶剂吗，说是呀，你说你再配一个介质试一下，结果数据正常了（当然这个正常结果是不能要的）。原来他在介质转入溶出杯后，剩下的介质给转移到一个量杯中，而这个量杯可能含有一点点东西，就造成了数据结果的偏差，而对照品溶液是用这个量杯内的介质配制的所以没有发现问题，所以最张的办法是，1）用转移介质到溶出杯的量筒盛放剩余的介质；2）要有介质相对空白的吸收值做参考。再进一步，要求所有的试管在清洁后必须加入规定量的纯化水检测UV值，只有小于一定值后才能倒置干燥后使用。再进一步，要求观察释放度检测最后一个时间点取样后样品的现象，由于标示含量中值为110%，所以如果小孔内有红色助推层溢出，则证明最后一个时间点的释放度约为110%，检测结果过高或过低均可能是由于释放介质被污染造成的。
这只是一个案例，当然还要注意的时，对于释放度检测来说（包括一致性），溶出度计算结果的累计是必须的，尤其是对于每个时间点取样量比较大的方法。
还有就是样品编码一定要清楚，尤其是样品数量非常大时，包括样品在HPLC中的放置必须严格与Sequence一致，检测前一定要Double Check一下，比较好的建议是如果可能的话不要蛇形排列，而是一列放6个样品。
4、人员
只有想不到，没有做不到，这里就不说了。
检验那回事之十——杂质谱研究之我见
写这个内容感觉是“没事找抽型”，毕竟这个概念在国内相对还比较新，说的人多估的人少，做的人都不说，而且网上一些“专家”更多的是把有关物质方法建立和验证放到这里，实质性的内容并不多，所以我写的内容可能挑战性比较大，也希望有不对的地方大家能够批评指正。
再强调一下，以下所有内容仅为个人看法，不代表任何官方（我从来对任何事物都不盲从，即使是法规/指南也要考虑为什么这么规定），仅供大家讨论和参考，以此要求做的申报得不到CDE/CDER的批准，本人概不负责！
有QC的人可能会说，我们只是检验，杂质谱与我有什么关系！但现实是，国内很多产品是没有做过这方面的研究的，当你发现你的产品/物料检测结果超标时，你就麻烦了，你要知道这个东西是怎么来的，只有知道它是怎么来的，才可能知道让它怎么没了！所以了解点没坏处，之所以放在QC版，主要还是考虑对系列内容的延续。
杂质，对于API，简单地说就是除了主成分之外的所有东西，包括水、残留溶剂、其他无机盐和有关物质。而对于无机盐，来源可能是试剂甚至水（例如氯化物）、催化剂（例如钯）、原料、设备（例如铁盐）等，一般只有毒性物质（例如氰化物、砷盐、汞盐等）或含量较高（例如氯化物、铁盐等）的杂质以外，一般不需要做专属性控制，而且这类化合物来源比较明确，且在生产过程中几乎不会发生明显变化（即使变化可能也会在检验中检测到），所以这部分内容不作为我这项研究的主要内容，有兴趣的可能参考ICH Q3D以及药典附录第VIII部分；至于说残留溶剂，由于一般比较惰性，在生产过程中发生变化的可能性也比较低，而且前面有第六章作为详细阐述（虽然还没写完），因此也不作为本章的主要内容。说到底，本章可以认为是对第七章内容的补充，甚至可以认为是前传，当然由于有“后传”作铺垫，所以本章对于方法建立和方法学验证的内容将不会过多阐述，有兴趣的可以看一下第七章。
我发现我的闲言碎语总是那么多，不多说了，到正文。
1、人员和设备要求
杂质谱研究，很大程度上来说就是杂质生成和杂质传递的研究，从某种意义上来说，一台有多元泵的LC-MS是非常必要的（虽然我没有过用），因为你要把这部分内容都委托出去做是不太现实的，尤其是API杂质谱。另外，对于有相当合成经验的专业人士也是必不可少的，这可以最大程度地减少工作量和误区，当然还要有专业的解谱能力。
2、对原料供应商的控制
做制剂的人都知道，变更API供应商要进行补充申请的，这一方面是由于可能不同供应商API之间的晶型和/或粒度可能不同，更重要的一点还有，其合成路线可能也是不一致的，会产生不同的杂质谱。
所以，对于API合成的原料也是一样的道理，不同的供应商也会有不同的合成工艺，进行产生不同的杂质谱，而这些不同的杂质谱可能会让你的杂质谱产生变化，所以非常必要的是要控制好原料的来源，并且要知道其合成工艺和杂质谱，这个杂质谱同样道理不能简单地通过你自己的几批检验结果简单地得出。而对于那些工艺总是不段变化的供应商，奉劝你就不要用了。
3、杂质预判
每一步反应，应有专业人士对可能存在的副反应作出预判，包括所有原料中所有杂质在同等条件下可能存在的反应，例如氯甲酸甲酯中可能会含有乙酯，那么乙酯可能会发生相同的化学反应进而产生乙酯杂质，必要时可以加大原料中相应杂质的量，以确定反应的存在（也就是相应杂质的存在）；苯环1/4位等异构体可能也同样存在这类情况。
要注意所有有选择性的反应（例如SN1/SN2、马氏加成等等）都可能会有反向杂质生成，所有氧化都有过氧化的可能性，所有水解也有过水解的可能性。
4、杂质定性
对于各步中间体，应采用粗品甚至反应液进行杂质分析，此时应考虑采用梯度的方法，尽可能保证所有峰能够基线分离（当然峰纯度也要符合要求），还要保证所有极性/非极性物质都能够检出，必要时可以分别使用反相/正相色谱条件分别检测，再根据LC-MS来确定每个色谱峰的结构。
必要时，可以使用过投料、过反应温度/时间/酸碱度等条件（但无需达到强制降解的条件），来确认是否识别出所有可能生成的杂质，甚至使用粗品进行投料以确定下一步产生的新杂质。
对于产生的第二个手性中心，应确保差向异构体能够检出。
必要时制备/提取出相应的中间体杂质，以备后续研究之用。
换句话说，这一步是为了得到每一步中间体的杂质谱。每一步都确定了，就得到了最后的工艺杂质谱。
5、强制降解研究
对于成品，强制降解研究是非常必要的，一方面是检验方法适用性的要求，另一方面是对贮存条件下进行杂质谱研究，需要注意的是，制剂强制降解研究应分别考虑制剂、主成分和辅料的分别进行，以确定杂质的来源。
6、杂质控制策略
杂质控制首先要在符合质量要求的基础上成本优先的原则，这就要求对于难以去除的杂质宜采用前端控制，例如位置异构体、同系物应尽可能在原料来源处控制；而对于易于除去且不参与下一步反应的杂质则可以根据成本的情况选择控制阶段和方法.
@hongwei2000 检验那回事之十一——对CDE仿制药质量控制的评价@hongwei2000
还是那句话，本文不作为对CDE和药品注册法规的解读，本人也没有能力和资格进行解读，更多的是想谈一下个人的想法，希望对于那些在仿制药申请中遇到挫折的研发和QC朋友能够提供一些心理支持，但以此作为依据所引发的退审和补充要求，本人概不负责。
本人已有六年多不做研发了，但同事也好，作注册的朋友也好，总是经常有些问题咨询，包括国内仿制药申请的，也包括进口再注册的；有被毙的，也有要求提供补充资料的。想写这部分内容是缘于最近网上有人开出了九问，本人试着一一作出评价，但想万一被人送个“九评”这个帽子风险可是非常大，所以还是自己站出来写点东西吧，内容可能也会更全面一些，受众也会更多一些。
首先，我想我们活在这样一个历史背景下，我们必须学会适应，适者生存嘛，在单位你要适应你的领导，注册你当然要适应CDE的要求，哪怕是不太近乎情理的、甚至有点过分的要求，毕竟你要品种，当然这不是可以数据造假的由头。只要你在申请时就按要求做到，退审和发补的机会就会降低，否则到时你在办公室里在网上报怨是没有任何作用的。当然在注册中，往往由于知识面和经历的限制，我们不能保证所有的东西都能得到CDE的认可，但最起码我们在前期的准备中充分准备了、调研了、查找了相关要求和文献，那么我们成功的机率就会升高。虽然在我做研发的时候退审率还不高，更多的是发补，但我每次发被都会总结，为什么发补，CDE对于被种情况是怎么要求的，国际上对这个问题又是怎么看的，久而久之，就能判断出CDE的要求，就会降低发补率。
大家可能都知道，国内注册有个知名的说法，叫做“仿制药，仿的是药品而不是标准”，这个话大概是在03年开始提出的，当时的情况是，国内仿制药品申请泛滥，尤其是注射剂，由于免临床的诱惑，往往是一家做资料几十家报，免临床的要求也在降低，几万块的资料遍地是，明明是要求处方一致，实际上批的免临床多去了，处方是否一致鬼知道，明明溶液中不稳定，被批成大小容量注射剂（例如著名的欣弗），仿制研究单位实际上在做的是到处找标准，找到标准后把限度改严（不管是否合理，比如我见过的一些品种含量范围从90.0%-110.0%改为95.0%-105.0%），剩下就是“扎针”。这种现象直到07年开始整顿后有所好转，便这句话即还是被保留至今。
事实上，现在CDE在审评中，恰恰执行的就是“仿标准”，虽然仿药品的要求依在，但在我看来，这个要求实际上并不是像一些网友所说的有多么严格，甚至相对ICH Q3A/B的要求来说，这个标准是相对较低的，真正可能有不平衡的人是觉得，为什么要我要求这么严，而原来批准的却不要求，甚至在标准统一和升级中仍不提高要求。究其原因，应该还是CDE与药典委要求不一致造成的，还有一种可能是可能如果加严标准，国内可能很多企业相应的品种就废了，一些品种将无药可用，药典委可不想担这个罪名，低价药导致的无药可用发改委已经担了罪名了。但无论如何，还是前面那句话，你要想要批文，你就得适应，况且如果你之前报怨过“日本人把最好的产品卖给自己本国人，其次的产品卖给欧美，三流的产品卖给中国”的话，那你为什么不生产最好的产品卖给国人呢？反过来，如果你有选择权（比如在药店），同样的药品，如果你知道标准不一致，你愿意选哪个呢。当然，后面的话都是安慰你自己的。
回过头来，再说审评要求，几乎所有人都知道，现在你仿制药如果想批下来，必须要比较各国药典（基本上是欧美），找到相同制剂品种或相同API的不同制剂品种，溶出度一致性我不说了，这个有专门的指南，这里要说的杂质要求。了解我或者看过我前面文章的人都知道，这是我非常熟悉的部分，有一部分内容可能在第七间和第十章中有所阐述，这一部分也可以看到是对第七章的适当补充。
要求1：杂质标准与同品种国际主流要求相比，不得更宽松。
这就是要求，你仿制品种相应杂质的标准均不得低于同品种（或同API不同制剂品种）欧美最严标准，包括特定杂质、未知杂质和总杂质。这里面隐含了一个要求，就是别人订到标准里的特定杂质你必须也是特定杂质，即使它没有超过鉴定阈值甚至报告阈值，除非是API的工艺杂质而不是降解物，并且你能够证明你的API合成工艺中不可能产生这个杂质；当然对于那些没有订入到标准里的特定杂质，如果是API且是你的工艺杂质，你也应考虑订入，如果是制剂，可以不订入，但在方法建立时应予以考虑。
要求2：与同品种国际主流标准相比，杂质不得更多。
这部分我的理解是，由于API的合成工艺是不同的，所以单纯的API工艺杂质不同工艺也就有所不同，你也不可能清楚地知道原研药的合成工艺是什么（不可能什么品种都像甲基苯丙胺工艺研究的那么细，研究杂质谱就知道合成路线），尤其是API的纯度都比较高，一般品种检出的杂质数目和量并不多，所以你买到的API杂质数目和量比原研高也是很正常的现象，但关键是这个杂质是什么，API是怎么控制的，如果仅仅是API的工艺杂质而不是降解物，且没有超过鉴定阈值，这个对于制剂来说，应该可以认为是与原研一致的。但如果这个杂质比较大，超过了鉴定阈值，你必须要进行鉴定，同时需要提供足够的理由能让CDE批准，例如，这个杂质在API中是符合国外主流标准API标准要求的（也就是说API可接受），而且该杂质在制剂中不会增加（依据Q3B的要求，仅仅是API的工艺杂质制剂中可以不控制）。当然，对于有些品种，我也遇到过，就是国外标准中并没有相应的特定杂质，但你的样品在稳定性贮存过程中会有所增加，甚至超过鉴定阈值，这时你就必须考虑对该杂质进行鉴定，再通过工艺来解决，否则通过的可能性极低。
要求3：毒性杂质控制要求高
我首次碰到这种要求是一个FDA的注册申请，那是一个苯磺酸盐的产品，FDA的补充要求说明苯磺酸酯类化合物具有潜在的致癌性，由于工艺中使用了乙醇作为重结晶溶剂，所以不排除产品中会生成苯磺酸酯类化合物，要求我们对这类化合物进行控制。后来又在一老外的关于清洁验证的一个讲座中得到一个案例：一产品在市场上发现安全性问题，结果最后的调查结果是由于产品清洁验证采用的是乙醇作为最终清洁剂，而清洁后又没有及时干燥，而后生产的产品是甲磺酸盐产品，而残留的乙醇与甲磺酸反应生产了具有致癌性的甲磺酸乙酯。
事实上，在欧洲药典上有专门的方法（2.5.38）用于检测甲磺酸酯类的残留量的，如果经常关注各国药典中的一些专论或附录，是可能发现一些类似的要求的，例如欧盟的GUIDELINE ON THE LIMITS OF GENOTOXIC IMPURITIE，既然国内已经在关注这方面的要求，收集一些数据和资料是不可或缺的。
要求4：检验方法必须一致吗？
答案应该是否定的，关键是你的方法要能保证你的杂质/潜在杂质能被检出。使用国外方法是有相当优势的：第一，你不需要再自己建立一个方法，哪怕是方法有所调整也有基础；第二，国外药典有明确的色谱柱规格，以及建议的品牌和填料，利于你重现；第三，今后国内标准升级或被药典收载时，采用这种方法的可能性非常大，如果你现在用自己的方法，以后上市后标准升级时你可能还要进行相应的变更。
当然，如果你调整了检验方法，那么第一，你要保证所有的特定杂质都能被检测到；第二，未知杂质数目不能少于原方法；第三，强制降解峰数目不能少于原方法；第四，保证方法检测的准确性，这就要求你可能要重新建立各杂质的校正因子和相对保留时间并验证（当然你用USP的方法也一样要验证）。方法建立和验证可以参照第七章。
最后，我想说一下，希望大家能够重视质量标准起草说明，也就是Justification，在这里面一定要特别强调你所有与国际标准相比不一致的地方，例如你方法调整的优点是什么，你杂质比别人多一个是什么东西是怎么控制的（例如API的内控标准），你所说的每一个字都可能为你避免被毙或发补打下良好的铺垫。
还有就是，由于国内的现状，往往可能API的标准甚至还要低于你即将申报的制剂标准，所以了解你的API工艺和稳定性是至关重要的，提供一个可行的杂质内控标准也是必须的，虽然在注册中不一定有这个要求，但我相信任何一个制剂生产企业都不希望自己去拍脑袋制定API杂质的内控标准，别闹个制剂生产出来就不合格或放置几个月杂质就超标的情况。
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发表于 2014-11-22 11:31:18
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