请教：关于沉降菌的测试问题

蒲公英

在“巍信智会”微信群里，有人提出一个问题，发到论坛，希望大家参与讨论，给一些意见：
  在指南当中，沉降碟的放置时间不宜过短，至少为半个小时，不大于4小时，针对这个理解我这边有几个疑惑：
  1、是否进行在层流情况，考虑要做沉降菌的排放时间段。
  2、对于紊流情况下的可否摆置不多余4个小时即可。
  3、对于沉降菌的摆放时间问题是：从肉眼看是没有看到水分挥发干，仍然像果冻的，能否就直接排放不多余4个小时即可；
  或者说如何确认摆放4个小时，如何做促生产试验？

叶非

我来回答下这几个问题。
沉降菌是属于一种被动取样的方法，因此沉降菌的放置时间不宜过短，过短的时间，取样没有意义；时间过长，会导致培养基长时间暴露，脱水影响微生物的生长性。所以，通常情况下，对于关键的区域，沉降菌和浮游菌是会同时进行的，因为浮游菌是一种主动取样的方法，环境监测的代表性会更好，但是浮游菌的取样点的设置，需要考虑取样时，不会对测试区域的流型产生影响。
所以：
1.沉降菌的放置时间，和是层流还是紊流没有太大的关系。通常情况下，沉降菌的摆放是和生产过程同步，贯穿到整个的生产过程。
2.沉降菌的摆放时间，是需要做验证的，这个验证其实很简单。按照正常的生产条件，暴露培养基，暴露4小时后，对培养基进行促生长实验，如果符合要求，就可以认为暴露后，对培养基的促生长性能没有影响。不用象楼上说的那么复杂。现在的国产的培养基，基本上也都能达到要求，不一定需要专门的培养基。比如说，上海诺迪的培养基。反正根据我在不同的4个公司的经验，还没碰到4个小时后，促生长实验有问题的情况。

蒲公英

根据GB和GMP附录静态半小时，动态大于半小时至4小时不等，动态时间其实是看你需要摆放多少时间，比如灌装时间只有45分钟就没有必要放到4小时，因为你监控的是灌装过程，但是4小时必须验证，据我了解到行业商购平皿，只有默克的一款可以做到4小时，并且有验证数据但是其培养基注皿量大几乎没有卖的企业，因为推不起来，如果自配或其他商购平皿一般注皿量15～25ml必须做验证，可在超净台下打开用层流风做，然后每隔一小时取相应平皿进行适应性检查，哪个时间段前还是符合要求，则以该时间作为今后换皿时间，大概2小时后有某些菌就长不出，4小时的失水量可以达到30%以上。

z344294209

顶下，我也有这方面的疑惑~~

米多ING

楼主问题很细，可能得药监局老师那些专家回答了。

蒲公英

我来回答下这几个问题。
沉降菌是属于一种被动取样的方法，因此沉降菌的放置时间不宜过短，过 ...[/quote]
回答精彩，鼓励这种交流
这方面专业，我是文盲，看都费劲，不过我可以复制粘贴到群里，供大家参考

huapingxie66

谢谢老大及天士力蒲友的回复，我在说下我的理解，对于灌封来讲，像我们的灌封时间比较长，10小时，所以过程当中必须得换皿，其实我是比较倾向能放置时间长点，我们现在放置的为3.5小时，然后计数按4小时来计数的。灌封操作间为B级，也要不断的换皿？直至生产过程结束？我们现在是比如说一个房间评估摆放6个点后，每个点摆放一次，计数平均与最大值。刚又看到老大的提出说是：促生产实验？怎样的促生产长呢？要是平皿的适用性跟培养基的适用性是不是一样的做法呢！

shacco

我来回答下这几个问题。
沉降菌是属于一种被动取样的方法，因此沉降菌的放置时间不宜过短，过 ...[/quote]
学习了，不过想问下您的第2条“沉降菌的摆放时间，是需要做验证的”是哪里规定的啊？

夏风萧雨

我来回答下这几个问题。
沉降菌是属于一种被动取样的方法，因此沉降菌的放置时间不宜过短，过 ...[/quote]
放4小时后是会出现促生长不过的，水分流失根风速换风次数有关的，应根据不同环境做不同的验证。你可以咨询上海诺迪的老师问问，他们做过这个实验的

zqtcqy

可以做下培养基的失水率的验证，看看水分流失对取样的影响

叶非

放4小时后是会出现促生长不过的，水分流失根风速换风次数有关的，应根据不同环境做不同的验证。你可以咨询 ...[/quote]
我在的公司都是实实在在的做过这些测试的！根据我在的公司的测试结果，暂时没有发现这些情况。这个和洁净区房间的换气次数不大，和沉降皿上方的气流的流动性有关，也和培养基本身的性质有关。我们测试的时候，是在生产条件下，布点进行测试，使用不同条件的皿，在暴露时候后，进行测试。我不清楚诺迪的实验是在什么条件下进行的？在沉降皿上方的气流是侧向流还是垂直流，风速大小是多少？

夏风萧雨

uiofer 发表于 2015-8-6 09:36
我在的公司都是实实在在的做过这些测试的！根据我在的公司的测试结果，暂时没有发现这些情况。这个和洁 ...

也不知道贵公司是在什么环境下做的测试，根据每个公司的环境不同做这个试验是很有必要的。这个摆放时间也是基于试验的结果

叶非

夏风萧雨 发表于 2015-8-6 09:45
也不知道贵公司是在什么环境下做的测试，根据每个公司的环境不同做这个试验是很有必要的。这个摆放时间也 ...

我似乎没有否认需要根据不同的环境去做这个试验啊！我们做试验很简单，比如说，环境监控的取样点在层流下，那么在同样的取样点，放置培养基，放置4个小时！放置后，培养基去做促生长实验！所以，我实在是不理解，在实验室里的模拟，能够代替生产么？在没有这些具体的数据的前提下！

青城/怒云

1、摆放时间与生产工艺相关，如生产时间少于半小时，也要摆放半小时以上至4小时以内；
2、半小时至4小时是培养基性质决定的，如超过4小时，可累积摆放，菌数相加；
3、摆放时间不能用肉眼判腚，要以计时为准；
4、对于乱流摆放情况也一样，做的是菌落，不管是什么流；
5、南南的要求是4小时以内，考虑到培养基的灵敏度及水份挥发等问题，个人建议最多摆放3.5小时后换蝶。

zouzijun

学习了各位老大

HZL-小梁

uiofer 发表于 2015-8-6 08:50
我来回答下这几个问题。
沉降菌是属于一种被动取样的方法，因此沉降菌的放置时间不宜过短，过 ...

,回答得很不错！

huapingxie66

B级区、C、D级取样的沉降菌，按是否也需要全程监控，我在思考这问题，要全程过程的摆放是不断的在做的，是很难做下去的。工作量很大。其实在我们的操作里面，也是没有规定的那么细致的，就是摆放就可以啦，所有操作人员都是一起摆放，一起收皿。

叶非

huapingxie66 发表于 2015-8-6 11:01
B级区、C、D级取样的沉降菌，按是否也需要全程监控，我在思考这问题，要全程过程的摆放是不断的在做的，是 ...

B/C/D级的是否需要全程监控，取决于你自己的风险评估。风险评估可以和人员活动、产品暴露、对产品质量可能的影响来考虑。比如说，更衣间，人员活动频繁的时间段是换班的时候，那么你的监控时间段，也就可以只设置在涵盖到这个换班时间段的监控。其他的房间，如果在生产期间很少活动，你可以不用设置取样点，或者取样频次放长，比如说一周或者一个月监测一次！动态的取样点和频次，是基于风险评估来确定的，论坛有相应的PPT，你可以搜索出来学习！

不拘小杰

  1、是否进行在层流情况，考虑要做沉降菌的排放时间段。
沉降菌作为一种收集环境菌的手段，目的并不是半小时或半小时至四小时又或四小时的监测，而是在于对关键区域的一个高风险连续监控，沉降菌检测并不能改变或者立即发现该区域的空气质量，沉降菌的目的更偏向于对于后期的异常结果的分析（产品检出菌的调查）和风险评估（产品虽然合格但是关键区域的连续监测发现大量沉降菌检出）。所以关于排放的时间段应该基于风险的高低。

  2、对于紊流情况下的可否摆置不多余4个小时即可。
参见回答一，所谓的4小时是因为培养基质量问题，而和监控本身的时间性无关。

  3、对于沉降菌的摆放时间问题是：从肉眼看是没有看到水分挥发干，仍然像果冻的，能否就直接排放不多余4个小时即可；或者说如何确认摆放4个小时，如何做促生产试验？
关于摆放4小时引用密理博关于环境监测培养基的一段研究
“沉降皿的一个关键问题是，由于暴露蒸发失水，导致琼脂表面越来越干，这可能会降低培养基的某些微生物的生长，从而导致在空气中的这些微生物比例的过低评估。过在一个典型的单向气流中4小时暴露，TSA板已被发现失重高达16％。然而，这样的平板接种典型污染物后培养，所有的回收率均在70％以上。为了延长暴露和培养的时间，同时确保平皿仍然提供可靠的结果，沉降皿可以浇注到一个特定的高浇注线。然而，最大曝光时间在每个生产线上进行验证，同时考虑到气流、温度和相对湿度”
最起码通过以上研究可以表面摆4小时是没多大问题的

luckylala

不可参考别的企业的数值，必须自己企业根据自己的情况做验证，因为各企业使用的平皿都不一样，有的是自配的有的是商购的，商购的还用的不同品牌的培养基，存放的温度也不一样有的2-8℃相对于2-25℃就是所谓常温存放失水的比例会低，同时浇注量也不一样；生产检测环境不一样，我们为什么选取超净台进行验证，因为我们生产环境是层流，我们超净台也是层流，风速同样是符合A级0.36-0.54m/s的标准，同时房间的风量和换气次数也是需要考虑的，这对培养基表面的失水非常相关，而且层流到培养基表面的距离也是需要考虑的点，同样条件下越近其失水率越高，所以还是要考虑不同企业的检测环境进行制定验证的环境，尽量挑战最严苛的环境做一次验证即可，根据经验A级层流下是做不到4小时的，建议2小时换皿；
另外适用性检查怎么做，这个非常简单，参考2015版药典，使用涂布法，对照为对照培养基制成的平皿（使用前建议预培养18-24h，一来确保无菌性，二来避免水分过多导致涂布结果菌株连片现象)，回收率满足50-200%即可，使用该培养基适用性挑战的所有菌株，平行三次，全部通过即为通过，以该时间点作为其换皿时间；
还有如果灌装短不足4小时，有争议的是要折算还是不折算到4h，这个完全看各企业自己定标，我问到现在很多企业都是折算的包括知名外企，也是更加严格的标准，如果时间超4小时，全程检测，那就可以一直换皿，但不建议折算成4h，建议加严分段处理，特别是A级区，任何一个捕捉到的微生物都应非常重视，个人观点仅供参考。