生物反应器或发酵系统培养基模拟

PRT-drgon

各位大佬遇到几个问题，求助不锈钢发酵罐培养基模拟1、根据发酵周期，TSB在发酵罐培养基模拟5天后（模拟补料、通气等），是继续放在里面罐体里面培养14天（按照相应的培养温度）？
2、放在罐体，通过试镜观察感觉看不全，怎么检测无菌，取样出来的吗？

世间始终你好

我把问题拆成两部分回答，并给出可直接落地的操作建议和取样/检测流程模板，方便你直接套用到 SOP/验证记录里。

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1）发酵罐内放置 5 天后是否继续在罐内培养 14 天？结论：可以也建议在罐体内继续放置并模拟整个 14 天观察期（前提是你要模拟真实生产/污染扩散条件），但同时应并行取样做培养学检测（见第 2 节）。理由和要点：

• 如果目的是模拟“整个发酵周期内罐体在通气、补料、温度、搅拌等正常工艺条件下是否会产生微生物污染并扩增”，那么在罐内按实际工艺条件继续放到 14 天是更贴近现实的验证/模拟方法（即在罐内做长期富营养模拟）。
  
• 如果仅做药典/无菌性/灭菌保持性验证，传统无菌检测常用14 天培养（两温度段或两套培养条件）来保证对慢长菌的检出。因此将罐体中样品在罐内保存并周期性取样送检，是较合理的做法。
  
• 注意风险控制：在罐内长时间放置会有液体蒸发、pH 变化、溶氧波动、补料导致营养改变等因素，记录这些参数（温度、pH、DO、流量、补料时间/量）并写入报告。
  
  

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2）“通过试镜观察看不全，怎么检测无菌？” —— 建议的取样与检测方案（可直接作为 SOP）试镜/目测不可靠，应以微生物学培养和必要的检测手段为主。下面给出一个具体、可执行的取样与检测流程模板。
A. 取样原则（无菌、代表性）

• 取样点：使用罐体专用无菌取样口/采样阀；若无，使用经灭菌的针头经隔膜阀穿刺取样。
  
• 取样工具：无菌针筒/采样瓶（带塞）、灭菌滤膜装置（若用膜过滤）、一次性无菌移液管等。
  
• 取样前处理：用无菌生理盐水冲洗取样口（若SOP要求），丢弃首批几 mL（通常3–10 mL）以去除外来污染。
  
• 取样量：根据检测方法：
  
  
  • 液体培养/肉汤富集：每次取 1–10 mL（放入带盖无菌管或瓶中）；
    
  • 膜过滤法：若预期低菌落或需检测大体积，用 10–100 mL（或更多）经 0.45 μm 滤膜；
    
  • 平板平板计数：适当稀释后涂布 0.1–1 mL。
    
    
• 频率/时间点（建议）：模拟期内至少每日或隔日取样一次；关键节点（补料后、启动/停止后）取样；模拟终点（第 14 天）取样。
  
• 阳/阴性对照：同时准备阳性对照（已知菌株接种的TSB）和阴性空白（灭菌TSB）以验证培养条件。
  
  

B. 检测方法（推荐多管并用）

• 肉汤富集（TSB/其他）
  
  
  • 将取出样品接种到无菌 TSB（或特定富集液）中，封口并在适宜温度下培养观察浑浊（常规 14 天观察期）。
    
  • 建议并行两套培养温度段：20–25℃（主检真菌/环境菌）和 30–35℃（检细菌），或按你单位既往做法设定。
    
  • 每日/隔日肉眼观察浑浊并记录；出现浑浊需做菌落分离鉴定（接种到固体培养基上）。
    
    
• 膜过滤法 + 平板培养（敏感度高，适合低负荷样品）
  
  
  • 过滤一定体积（如 10–100 mL）通过 0.45 μm 滤膜，将滤膜置于 TSA/SDA 等固体培养基上或转入富集液培养，按两温度段培养并观察。
    
  • 方便计数和菌种鉴定。
    
    
• 平板涂布计数/稀释涂布法
  
  
  • 对于高负荷样品，按 10 倍系列稀释，取 0.1–1 mL 涂布于平板，37℃/30℃ 培养后计 CFU。
    
    
• 快速检测手段（可选）
  
  
  • ATP 荧光：快速筛查，但假阳/假阴较多，作为辅助手段即可。
    
  • qPCR：能检测特定微生物/快速筛查，但检测到 DNA 不代表存活菌。
    
  • 生物监测（空气/表面）若要模拟罐外扩散可并行。
    
    

C. 培养条件与判定

• 培养观察期：推荐 14 天（符合药典/常规无菌检测习惯），每日记录。
  
• 两个温度段：20–25℃ 与 30–35℃ 各一套培养，以覆盖嗜冷、嗜温与真菌。
  
• 判定：若任一培养瓶/平板出现浑浊或菌落，则判为阳性，需进一步分离鉴定（菌种、CFU 计数、可能来源分析）。无菌结论需所有平行样全部阴性，并且阴性对照合格。
  
  

D. 无法用“肉眼试镜”判断时的操作建议

• 不要只靠试镜。若视野受限，必须取样送培养。
  
• 若要在罐内直接“观察”，可用无菌透明取样管/取样器吸出固定体积到透明培养瓶里，在培养箱/摇床观察浑浊变化，便于拍照留证据。
  
• 对于小量污染，早期常看不到浑浊，但通过膜过滤或富集可检出——因此取样+富集是核心。
  
  

E. 记录与可追溯性

• 每次取样记录：罐号、取样时间、取样人、操作环境（门、人员流动）、罐内参数（温度、pH、DO、转速）、样品编号、送检时间。
  
• 保存培养图片、平板照片、鉴定报告（若阳性）及处置记录。
  
  

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实际操作举例（简短 SOP 样板）

• 第 0 天：用无菌 TSB 装入罐并按工艺启动，记录参数。
  
• 第 1、3、5、7、10、14 天（或每日）从采样口取 10 mL 放入无菌管（编号）；并取 100 mL 做膜过滤；同时取 1 mL 接种到 10 mL TSB（两套温度培养）。
  
• 送检：将样品在 30–35℃ 与 20–25℃ 两个培养箱分别培养 14 天，日查记录。
  
• 若出现浑浊或菌落，立即进行莳殖分离鉴定并追溯环境/工艺点（补料、接种口、搅拌轴密封等）。
  
• 完成报告：附所有培养记录、照片、菌种鉴定、结论与改进措施。
  
  

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其他注意事项（风险点与小贴士）

• 取样口/阀门本身是污染源，取样时先消毒并丢弃第一口样品。
  
• 补料管路应与取样管路分开记录；补料时取样可能更容易检测出因补料引入的污染。
  
• 若罐内为厌氧发酵，要考虑采用厌氧培养条件或厌氧平板以检出厌氧菌。
  
• 保持阴性对照（灭菌TSB未接样），以证明培养条件无外来污染。
  
• 若这是作为监管/申报资料，请把方法按企业 SOP 固化并做一次或多次重复验证（证明方法的灵敏度与特异性）。
  
  

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18943082964

世间始终你好 发表于 2025-8-13 12:29
我把问题拆成两部分回答，并给出可直接落地的操作建议和取样/检测流程模板，方便你直接套用到 SOP/验证记录 ...

我的神！！！！

PRT-drgon

世间始终你好 发表于 2025-8-13 12:29
我把问题拆成两部分回答，并给出可直接落地的操作建议和取样/检测流程模板，方便你直接套用到 SOP/验证记录 ...

感谢大佬，基本上解答我的全部的疑问

拐角1

反应器/发酵罐的无菌培养一般根据生产周期来，对于无菌测试，不是单纯的罐体的无菌的测试，包括灭菌程序的无菌测试，培养基灭菌或者过滤的无菌测试，日常操作类无菌测试，每次测试完后可以进行取样，QC送检就可以，要是染菌，按照罐体里的通气和搅拌再加上营养条件，差不多当天夜里细菌就会大爆发，直接看溶氧和pH数据基本上就知道了

故障代号007

如果是模拟生产的话就一样的周期吧，取样也按照生产的节奏来

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验证师

世间始终你好 发表于 2025-8-13 12:29
我把问题拆成两部分回答，并给出可直接落地的操作建议和取样/检测流程模板，方便你直接套用到 SOP/验证记录 ...

厉害，赞，厉害，赞。