防护服面料初始污染菌的检验方法

陈利欣

我公司防护服面料初始污染菌的检验方法：取1g，剪碎，加入到20ml0.9%无菌氯化钠，振荡5分钟洗脱微生物，薄膜过滤法，每10ml一个膜，共制备2个膜。结果：2个膜的菌落数的和为检验结果。限度：100cfu/g。
这个计数的方法学需要加标准菌的量，药典规定“所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%”，就是我只能在10ml里加入0.1ml菌液吧，这样理解对吗？大家是怎么做这类产品的初始污染菌的，供试液是如何制备的？

世间始终你好

好——把你的关键问题先直接回答，然后给出一个可操作的、可验证的方案和常见注意点，方便你做方法学验证和日常检测。
直接回答（关于“1%”的理解）

• 药典里说“所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%”。这个 1% 是针对 你加菌的那个“供试液（test solution）”的总体积 来算的。
  
  
  • 如果你把整份供试液为 20.0 mL，那么允许加的菌液体积上限为：20.0 × 1% = 20.0 × 0.01 = 0.20 mL（即 200 µL）。
    
  • 如果你把供试液按 10 mL 分成两份并且分别独立加菌，那么对每份 10.0 mL，允许加的菌液体积为：10.0 × 1% = 0.1 mL = 100 µL。
    
    
• 所以你写的“只能在10 mL 里加入 0.1 mL 菌液”——在你按每 10 mL 分膜且针对每份单独加菌时，这个理解是正确的；但如果你是向整个 20 mL 供试液一次性加菌并混匀再分装过滤，则上限是 0.2 mL。建议把“加种”动作做在总供试液（20 mL）上一次性加入并混匀，这样更均一，且仍满足药典 1% 限制（0.2 mL）。
  
  

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建议的检验与方法学验证方案（可直接采用或作为参考模板）一、供试液制备（基线/日常检测）

• 样品量：取试样 1.00 g（精确至 0.01 g），剪成小片或剪碎以利微生物洗脱。
  
• 洗脱液：取 20.0 mL 0.9% 生理盐水（无菌）；为改善纤维表面释放，可在方法学验证阶段比较是否需要加入表面活性剂（如 Tween 80 0.01–0.1%）或 0.05%中性洗涤剂，但日常若无化学抑制应优先用纯生理盐水。
  
• 洗脱方法：将样品与 20 mL 洗脱液置于无菌管/袋中，振荡（vortex）5 min 后可加短时超声（若验证证明对菌不造成杀灭影响，超声例如 1–5 min），或使用 stomacher 搅拌 1 min（用于织物通常 stomacher 效果好）。你现在用振荡5分钟是可接受的——但验证时要比对不同洗脱条件的回收率。
  
• 分装过滤：按你现有流程把 20 mL 分为 2 × 10 mL，每 10 mL 通过一张 0.45 µm 过滤膜（或 0.22 µm 取决于方法），培养计数。也可以整个 20 mL 用两张膜串联过滤（上、下膜区别记录），或两张并列各过滤 10 mL ——关键是要在方法学验证时确认不同方式间一致性。
  
• 培养：细菌用 TSA 平板（或适用培养基），培养条件比如 30–35°C，48–72 h（按药典/企业内控）；霉菌/酵母另取 SDA 培养并 5–7 天培养。
  
  

报告方式：你当前做法“2 个膜的菌落数之和即为检验结果（CFU/g）”是合理的（因为总供试液代表 1 g 样品）。注：若只过滤部分液体或稀释后过滤，结果需折算回 CFU/g。

二、方法学（回收率、加标对照等）——推荐验证项目

• 回收率（recovery）研究
  
  
  • 选 2–3 种代表菌株（常用：Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa、Bacillus subtilis 或 G+、G−、酵母）作为回收性评估菌种。
    
  • 对每种菌：按低、中、高三个加标水平（例如接近检测限、接近临界限度/半限、较高水平）进行加标，加种体积不超过供试液体积的 1%（见上面的 0.2 mL / 0.1 mL）。例如：若目标加标量是 ~100 CFU/g，可用已知滴度的菌液稀释后加入 0.1–0.2 mL。
    
  • 处理：加菌→混匀→按常规洗脱/过滤/培养→计数。计算回收率 =（测得 CFU / 加入 CFU）×100%。
    
  • 目标/可接受性（常用经验值）：回收率 ≥ 50%（最好 ≥ 70%）；不同实验室可接受范围 50–150%；相对标准偏差（RSD）通常 ≤ 25%。若回收率太低需改进洗脱条件或增加表面活化剂/超声等。
    
    
• 空白与阴性对照：同时做无样/空白过滤，确认培养基和流程无污染。
  
• 阳性对照（方法可行性）：在无样品条件下直接过滤已知 CFU 的培养液，确认培养/计数流程能准确计数（这验证培养体系本身）。
  
• 检出限（LOD）与定量限（LOQ）：基于方法和过滤体积估算，例如若 20 mL 全部过滤且最终培养能检测到 1 CFU，则折算到 g 的最小可检出数；实际通常按统计法确定。
  
• 回收一致性/稳定性：重复做 6 次或更多，计算平均回收率与 RSD。
  
• 抑菌物质/中和剂验证：若样品可能含有消毒剂或杀菌残留，需验证洗脱液中是否需加入中和剂（例如含残留消毒剂的衣物需加相应中和剂并验证中和效果）。
  
  

三、关于“加标”的具体操作建议（实践层面）

• 建议把菌液加入到整份 20 mL 的供试液里（可加入 0.1–0.2 mL，遵守 ≤1%），加入后充分混匀（涡旋+瞬间振荡），然后再分 2×10 mL 过滤。这样保证两个膜上的菌均匀分布，减少偏差。
  
• 加标菌液要用计数准确的稀释液（事先做落菌平板计数确定滴度，或用光密度换算并做验证）。
  
• 记录加入菌液的 CFU（按加入体积 × 菌液滴度计算），并以此作为回收率分母。
  
  

四、培养与计数细节（推荐）

• 膜孔径：0.45 µm 常用于常规细菌过滤捕获。
  
• 每张膜放置于适当培养基表面或转移到含培养基的平皿上培养。
  
• 培养温度/时间：细菌 30–35°C，48–72 h；酵母霉菌 20–25°C，5–7 d（按药典/产品风险调整）。
  
• 计数：若某张膜上菌落过多（TNTC），需在方法学阶段确定稀释方案或减少过滤体积以使每张膜落在可计数范围（通常 30–300 CFU/膜）。
  
  

五、结果报告与限度

• 你当前限度 100 CFU/g，报告时按样品 1 g 的总和（两个膜 CFU 之和）直接比较限度。若做稀释或只过滤部分体积，需折算回 CFU/g。
  
• 若有多次并行样品，给出平均值和单次结果并注明回收率/方法学验证状况（若回收率低，结果需注释）。
  
  

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小结（要点速查）

• 药典 1% 是针对你加菌的那份供试液总体积计算：20 mL → 上限 0.2 mL；10 mL → 上限 0.1 mL。
  
• 推荐把菌一次加入 20 mL，混匀后再分装过滤（更均一）。
  
• 方法学验证要做回收率、空白、阳性对照、抑菌物质验证，并给出可接受的回收率/RSD（经验值：回收 ≥50% 且 RSD ≤25%）。
  
• 可考虑在洗脱液中加少量表面活性剂或采用超声/搅拌以提高回收——但必须验证不会杀死菌且回收可接受。
  
  

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陈利欣

世间始终你好 发表于 2025-8-13 17:38
好——把你的关键问题先直接回答，然后给出一个可操作的、可验证的方案和常见注意点，方便你做方法学验证和 ...

感谢教授专业的回复。还有个问题，对于医械初始污染菌的方法学验证，可以不需要遵循药典1105里的5种标准菌株是吗，我可以选择其中的2-3种，甚至只加金葡可以吗（我们的物料不抑菌的）。

世间始终你好

陈利欣 发表于 2025-8-13 18:00
感谢教授专业的回复。还有个问题，对于医械初始污染菌的方法学验证，可以不需要遵循药典1105里的5种标准 ...

可以不盲从地“必须用药典1105 的全部 5 种菌株”，但随意只用金葡（Staphylococcus aureus）通常不够稳妥——尤其是面对监管审评或事后质疑时。下面把理由、合规风险、可接受的折衷方案和一个可直接用的验证设计要点给你，方便你立刻用来做方法学验证/内审说明或写成报告。
关键结论（先看结论）

• 理想做法：至少选择 2–3 种代表性菌株，覆盖不同类别（至少含 1 个革兰阳性、1 个革兰阴性、且如果产品可能遇到芽孢或真菌风险，加入芽孢形成菌或酵母/霉菌之一）。
  
• 可接受的例外：如果有充分的科学理由与数据（例如材料化学/工艺/历史监测数据证明只出现某一类菌且回收性试验表明单菌代表性良好），可以用 1 种或 2 种菌做验证，但必须把理由写清并用数据支撑（回收率、可重复性、抑菌物质验证等）。
  
• 监管角度：偏好“代表性菌种+风险论证+数据支持”，直接只加金葡容易被问为什么不检验革兰阴性/芽孢/真菌的回收性。
  
  

为什么单用金葡不够

• 细胞表面特性差异大：革兰阳性、革兰阴性、芽孢、真菌在粘附性、耐洗脱性、对超声/搅拌/表面活性剂的响应不同。金葡回收好并不代表革兰阴性或芽孢也回收好。
  
• 抑菌/中和问题：某些物料对 G– 有更强的抑制或释放抑制性物质（内毒素不是菌落影响，但存在差异）。
  
• 审评风险：审评人员或第三方检测机构常会要求证明你选择菌种的代表性与充分性，单菌通常需要更多补充数据证明合理。
  
  

推荐的最小菌株组合（实用且常被接受）

• 最优（推荐）：3 株
  
  
  • 革兰阳性代表：Staphylococcus aureus（金葡）或 Staphylococcus epidermidis
    
  • 革兰阴性代表：Pseudomonas aeruginosa 或 Escherichia coli
    
  • 芽孢/抗逆代表：Bacillus subtilis（如关注抗压力/芽孢问题）或当关注真菌时用 Candida albicans /霉菌
    
    
• 最低可接受（有充分论证时）：2 株（一阳一阴）
  
• 仅金葡：仅在有强有力数据与风险评估支持下才考虑（并要有额外实验证明其代表性）。
  
  

如果你决定少于 3 株，必须做好的数据和文件

• 代表性论证（书面）：为什么目标环境/材料主要暴露于某类微生物（历史监测数据、工艺/储存条件、微生物谱）？
  
• 比对实验：至少对 2–3 个不同类别做平行回收实验（哪怕只做一次对照），证明金葡的回收率代表其他类别（差异在可接受范围内）。
  
• 回收率与重复性数据：每个验证菌做至少 3–6 个平行（常见 n=3 或 n=6），计算平均回收率与 RSD。给出接受标准（建议：回收率 ≥50%（最好≥70%），RSD ≤25%）。
  
• 抑菌物质/中和验证：验证样品洗脱液中无抑菌效应或加入合适中和剂并验证中和效果。
  
• LOD/LOQ 评估：说明最低可检出/可定量限。
  
• 方法边界：写明该验证只适用于“非抑菌材料、检测条件、洗脱方法”等边界条件，若流程/材料改动需重新验证。
  
  

推荐的验证设计（可以直接用）

• 菌种：金葡、P. aeruginosa、B. subtilis（或选 E. coli / C. albicans 根据风险）
  
• 加标水平：低（ ~10–50 CFU/g）、中（ ~100 CFU/g，接近限度/临界值）、高（ ~500–1000 CFU/g）
  
• 加菌体积：遵守药典 ≤1% 的规则（例如 20 mL 供试液上限 0.2 mL），并在整份 20 mL 上一次性加菌后混匀再分装过滤。
  
• 平行数：每个菌种每个加标水平至少 3 平行（n=3），建议中/高水平做 6 次用于统计。
  
• 处理与计数：按你现有流程（1 g → 20 mL → 振荡 5 min → 2×10 mL 过滤 → 两膜合计 CFU）
  
• 评价指标：回收率、RSD、方法线性（不同加标水平）、盲样检测（自然污染样）
  
• 接受准则示例：回收率 ≥50%，RSD ≤25%，在中水平能稳定计数且折算回 CFU/g 与理论值偏差在±50%（或更严格因子按你内部要求）。
  
  

实务建议（减少审评风险）

• 如果想走“精简菌株”路线，在报告里把风险评估写全并给出对照数据（比如用 P. aeruginosa 做 1 次对照，显示回收率与金葡差异 <20%），并说明为何不需要额外菌种（历史监测、材料化学、用途、无抑菌特性等）。
  
• 保留并提交原始实验数据（落菌平板图、稀释记录、培养条件、菌株来源/批号）。
  
• 在SOP里明确“若样品为抗菌或含抑菌成分，必须重新做全面验证（含更多菌株）”。
  
  

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雲jsg2svww

陈利欣 发表于 2025-8-13 18:00
感谢教授专业的回复。还有个问题，对于医械初始污染菌的方法学验证，可以不需要遵循药典1105里的5种标准 ...

可以只选一种菌种去做回收率，方法学验证就还是得5种标准菌株都要，你得证明你们的物料对标准菌株没有抑制效果，口头上的述说审查的时候是认可不了的

陈利欣

世间始终你好 发表于 2025-8-13 18:06
可以不盲从地“必须用药典1105 的全部 5 种菌株”，但随意只用金葡（Staphylococcus aureus）通常不够稳 ...

嗯嗯，感谢老师专业的解答

陈利欣

雲jsg2svww 发表于 2025-8-13 18:13
可以只选一种菌种去做回收率，方法学验证就还是得5种标准菌株都要，你得证明你们的物料对标准菌株没有抑 ...

是的，方法学这样最稳妥。感谢回复