生物制品原液冻融曲线研究

米斯特道格

请教各位大佬。在工艺验证指南中，提出了冻融工艺验证的要求。
也查看了一些文献和研究资料，发现大家所研究的冻融温度曲线主要展现的结果是：不同温度及环境下的相变时间和总的冷冻、化冻时间。
但实际生产过程中大部分使用的化冻方式都是-80℃冰箱冷冻，室温化冻/水浴化冻。
这种化冻方式如何通过冻融工艺开发确认相应的冻融工艺参数（仅控制总的化冻时间吗？）？如果评估生产放大体积后的影响？
理论上体积增大后冷冻以及化冻时间会增加，这种差异如何评估？

还有就是提到了程序控温或者是梯度控温。
程序控温如何进行设置，是5℃到-80℃到-10℃到-20℃到-40℃到-80℃这样的方式吗？这种程序设置为什么会有一些优势？
请各位大佬不吝赐教。

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世间始终你好

好——把你关心的关键点分成“要测什么 / 怎么测 / 如何放大 / 程序控温如何设定 / 验证/放行判定”5部分，给出可直接拿去做的小型实验方案、放大评估策略和典型放行判据，并把要点与文献依据并列，便于写报告或审评答复。

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1) 验证时要控制、要记录的不只是“总化冻时间”实际影响质量的并不是单一的“总化冻时间”，而是整个时温曲线相关的物理量，至少应记录/控制：

• 冷却/冻结阶段：起始温度、冷却速率（°C/min）、核化温度或冰点、从液态到“90%冻结/中心结冰”所需时间、最终保温温度与保温时间。
  
• 冷冻库静置/保藏阶段：贮存温度波动、瞬态回温事件（若有）。
  
• 化冻（复温）阶段：升温速率（°C/min）、中心点（container core）解冻时间（time-to-thaw for the coldest point）、解冻方法（室温、静置、37℃水浴、循环水浴、摇床等）、是否有搅拌/翻转。
  
• 过程次数/循环数：需要确定单次或多次冻融后的影响（常见1、3、5次等）。
  
• 关键位置的温度记录：尤其是“容器最不利点”（通常是容器中心或靠墙最远点）的热偶或探头曲线。
  
  

这点在过程表征/工艺表征文献中强调：freeze–thaw 的影响取决于冷/热通量与冰前沿移动（即时温曲线），而非仅仅“时间”。

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2) 小规模开发（过程表征）——可直接做的实验矩阵（样本/步骤）目标：找出对关键质量属性（CQA，如活性/含量/聚集/颗粒/外观/pH/渗透压等）敏感的变量，并建立“等效性准则”。
A. 先做时温映射（mapping）（所有后续都基于这些曲线）

• 用代表性容器（与放大生产同形状材料）和代表性体积（比如1/10、1/4、1×实验体积等）装样；在“最不利点”放置热偶（中心/角落/靠壁），在外表面也放热偶。
  
• 在常用冷冻方式下跑出时温曲线：-80°C箱体冷冻到-80（记录冻结时间、核化特征）、-20℃箱、液氮（若用）等；化冻方式要做至少两种：室温台面化冻、恒温水浴（设定温度）、有/无轻微搅拌。记录每次的升温曲线与time-to-fully-thawed（中心点）。
  
• 建立“冰分数 vs 时间”或用中心点温度作为判据（比如从 -20°C 升到 -5°C 用时，或达到 -1°C 的时间）。文献常用中心点time-to-thaw或time-to-90% thaw作为关键标识。
  
  

B. 设计因子试验（小规模）

• 因子：体积（V）、容器几何/壁厚、冻结速率（快/慢）、化冻方式（室温/水浴/循环水浴/摇床）、是否摇晃/翻转、是否程序控温 vs 直接放入-80。
  
• 终点（测CQA）：活性/效价、聚集（SEC/DLS）、可见/亚微颗粒、pH、渗透压、不得有可见沉淀或色变等。
  
• 建议做 3–5 个代表性体积 × 2–3 个化冻方式 × 0/1/3 次循环 = 可容纳的矩阵（优先找出 worst-case）。相关的设计与缩放策略在 freeze–thaw 专文中有示例和建议。
  
  

• 活性/含量：应在验证前定义允许变动（例如±10% 或依据放行规格/稳态数据）。
  
• 聚集物（总聚集% 或低量高敏检测）：不得超过基线增加x%（x需基于早期表征并与稳定性/安全相关性讨论确定）。
  
• 可见颗粒/外观：不得出现肉眼可见沉淀或色变；亚微粒在允许范围内。
  
• 功能类指标（如生物活性）：与基线比较具有统计意义的差异判定方法（t检验/等效性界定）。
  这些判据需在验证计划中事先定义并经质量/注册讨论确认。
  
  

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3) 放大（生产体积增加）时如何评估与放大策略体积放大通常会导致冻结与化冻时间延长且温度梯度更大，从而产生更明显的“空间不均一性”（局部溶质浓缩、冰前沿差异）。放大验证应包含：
A. 以“等效时温曲线”做尺度化原则

• 放大时尽量复制关键位置（容器中心/最冷点）的时温曲线（或至少关键参数如“time-to-90% frozen / time-to-fully-thawed”）与小尺度匹配。文献建议 scale-down 模型基于匹配时间-温度曲线或冰前沿传播特征。
  
  

B. 可用的工程方法

• 经验匹配法：在放大容器内置多点热偶监测，运行典型冻结/解冻操作，记录中心点曲线；若与小样匹配则可认为物理相似。
  
• 用热工模型/CFD或半经验模型预测：当无法直接做完全等效试验时，可用传热建模估算时间尺度，并再以关键点（中心）做验证。Geraldes 等讨论了这类 scale-down 策略。
  
  

C. 放大试验建议

• 在放大体积里做至少 1–3 次代表性批次（最好是真生产容器），在“最不利点”放热偶并测 CQA（与小样对比）。如果放大后关键CQA在既定接受范围内，则可认为放大可接受。
  
• 如果放大导致解冻时间延长且CQA受影响：可以采取程序控温（见下）、改良容器（薄壁、散热片）、在化冻时加入温和搅拌/翻转、使用循环水浴或控温箱统一化冻条件等工程手段以恢复等效性。
  
  

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4) 程序控温（programmed temperature control） vs 直接放入（-80 冰箱然后室温化冻）——什么时候用，如何设置为什么要用程序控温（controlled-rate freezing / controlled thawing）？

• 可控制冰晶的形成速率与尺寸、减小局部浓缩和冰晶应力，从而降低聚集/变性风险；可把“不可控的瞬时应力”转成可重复、可表征的曲线，便于QbD/验证。
  
  

程序如何设计（原则）

• 程序应基于目标品的敏感性与开发时测得的时温响应，不是凭空设定很多温点。常见要素：预冷速率、核化步骤、慢速通过冰晶关键窗口（例如 -5 ~ -20°C 之间），以及最终快速降到贮存温度（-80°C）。
  
• 一个示例性（需要用开发数据证实才可作为验证）程序（仅供参考）：
  
  
  • 起始室温（+4~20°C）→ 以 0.5–5 °C/min 速率降温到接近冰点（理论冰点由溶液成分决定）。
    
  • 在核化温度处短暂停留以诱导受控核化（如果有能力/需要）。
    
  • 以较慢速率（例如 0.5–1 °C/min）通过关键冰晶形成窗口（例如 -5 至 -30°C，具体取决于体系），以形成较均匀的小冰晶或较可控的晶体。
    
  • 当核心温度达-40~-60°C时，可加速降到-80°C 并转入长期保存。
    
  • 解冻可设计为：控速升温到 -20°C（慢）→ 再以较快速率回到室温或指定温度（或直接水浴快速解冻，视哪种对CQA更友好）。
    
    

注意：上述温点/速率只是范例，真实程序必须基于小尺度的时温-质量关系来优化。文献也讨论了不同速率通过关键温区对聚集/冷休克的影响。
你的例子里写的“5℃ 到 -80℃ 到 -10℃ 到 -20℃ …” 这种跳跃式设定是没有工程意义的（看起来像随机跳转），可取的做法是定义有意义的阶段与速率（例如分段线性 ramp，或者带有核化/保温步骤），而不是很多无根据的温点。这类分段 ramp 能带来优势：重复性好、 ice front 可控、减少局部超冷与快速重结晶风险。

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5) 具体可执行的验证/放行方案（样板式）（A）开发/验证阶段

• 做时温映射（见第2A），确定“最不利点”（最慢解冻处）。
  
• 在小规模上做 3 个典型化冻方式（室温、静水浴、摇床水浴），每种测 1 次完全时温曲线并测 CQA（初始、解冻后马上、24h后）。
  
• 基于小样选出“worst-case 化冻方式”（比如室温解冻中心点耗时最长且CQA 变差最大）。
  
• 在小样上用程序控温探索：不同降温/升温速率下CQA差异（如 0.5 vs 2 °C/min），以确定“推荐程序”或“放行限值”。
  
  

（B）放大/工厂验证

• 在生产体积上安装热偶（中心、角落、近壁），运行完全的冻结-贮存-化冻工艺（至少 2–3 批）并与小样关键时温参数比对（如中心点 time-to-90% frozen/ thaw）。
  
• 如果放大中心点曲线比小样慢 20–30% 且CQA仍在接受范围，则可接受；如果CQA超标，需采取工程措施或变更化冻方法（例如使用控温水浴、翻转、程序化升温等）。（具体%阈值需与质量/注册讨论并给出依据）。
  
  

（C）放行与监控

• 放行文件中写明：允许的最大化冻时间（或允许的time-to-thaw区间）、允许冻融循环次数、推荐化冻方法（水浴/室温/机械），并要求每批次在关键位置做温度记录（或至少抽查）。
  
• 将关键CQA（活性/聚集等）纳入放大再验证或批间稳定性监控计划。
  
  

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附：一些实务注意点与常见误区

• 不要只控制“总化冻时间”：同一“总时间”下，不同的时温曲线（快冷慢解/慢冷快解）对CQA影响不同，故需要用中心点曲线或冰分数作为物理等效判据。
  
• 容器形状/壁厚很重要：同一体积但壁厚不同、材料不同，会显著改变传热系数，进而改变时温曲线。放大时要把容器/包装因素考虑进来。
  
• 水浴快速化冻虽然快但风险也不同：快速复温可减少再结晶时间，但对一些敏感蛋白会导致局部过热或表面应力；所以必须基于CQA比较后选择最优方法。
  
• 建模有用，但必须结合实测：CFD 或简单传热模型能帮你预测放大趋势，但必须用实际热偶数据验证。
  
  

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推荐的最小文档/报告内容（写在验证报告里）

• 目标与范围（产品、容器、体积）
  
• 小尺度时温映射图（多点热偶曲线）＋ CQA 前后对比表格（数值与统计）
  
• 确认的“worst-case 化冻条件”说明与选择理由
  
• 推荐的生产工艺参数（冻结速率、保温、放入-80 的条件、化冻方式、允许的最大time-to-thaw或曲线）
  
• 放大验证数据（生产体积热偶曲线与CQA）
  
• 放行判据与批放行监控要求
  
  

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参考（建议在报告/审评里引用的代表性资料）

• Weber D. 等，Temperature Based Process Characterization of freeze-thaw operations — process characterization 强调用时温曲线进行表征。
  
• Jain K. 等，Freeze–thaw characterization process to minimize...（系统化选择冻融条件）。
  
• Rayfield WJ., Impact of Freeze/Thaw Process on Drug Substance — 关于 scale-down 建议与策略。
  
• Bioprocess International 的综述文章（小规模研究设计的建议）。
  
• Geraldes V. 等，A New Perspective on Scale-Down Strategies for Freezing — 关于时间-温度匹配的建模/缩放策略。
  
  

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米斯特道格

世间始终你好 发表于 2025-8-21 09:47
好——把你关心的关键点分成“要测什么 / 怎么测 / 如何放大 / 程序控温如何设定 / 验证/放行判定”5部分， ...

AI回复就算了把。

红烧牛肉面

我们做的比较少且委外，这个到没仔细想过
帮顶一下，坐等大佬

米斯特道格

红烧牛肉面 发表于 2025-8-21 10:54
我们做的比较少且委外，这个到没仔细想过
帮顶一下，坐等大佬

请教一下，您这边是委外做的冻融温度曲线吗？
就是我比较疑惑的点是生产室温化冻的情况下，工艺转移给生产时，以及工艺验证的时候，对于冷冻、化冻给定的工艺参数是什么那？
研究工作都可以研究到相变时间，但生产过程中总不能每个化冻的袋子都插个探头检测相变时间把。

红烧牛肉面

米斯特道格 发表于 2025-8-21 11:06
请教一下，您这边是委外做的冻融温度曲线吗？
就是我比较疑惑的点是生产室温化冻的情况下，工艺转移给生 ...

这个我确实不了解