细菌内毒素

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产品的细菌内毒素限值为20EU/件，细菌内毒素工作标准品为10EU/支，鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml,如何做细菌内毒素检查？求详细步骤，特别是供试品溶液稀释这步。

你我生而平凡

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胜利者

哈哈

机智鼠

细菌内毒素检查是确保医疗器械和药品安全性的重要步骤，特别是对于直接接触血液或体液的产品。以下是进行细菌内毒素检查的详细步骤：

1. 准备阶段：首先，确保所有使用的设备和材料都是无菌的。这包括实验台、移液器、试管等。同时，准备好鲎试剂、细菌内毒素工作标准品以及供试品溶液。

2. 稀释供试品溶液：根据产品的具体要求，将供试品溶液稀释至适当的浓度。通常，这一步需要使用无菌的生理盐水或其他适宜的溶剂。稀释倍数应根据产品的特性和预期的细菌内毒素限值来确定。例如，如果产品的细菌内毒素限值为20EU/件，而鲎试剂的灵敏度为0.25EU/ml，那么至少需要将供试品溶液稀释到8倍（即20EU/件 ÷ 0.25EU/ml = 80EU/ml），以确保在检测过程中不会超过鲎试剂的检测限。

3. 添加鲎试剂：向每个试管中加入一定量的鲎试剂。具体用量应根据鲎试剂的说明书和实验设计来确定。

4. 孵育：将含有鲎试剂和供试品溶液的试管放入恒温箱中孵育一段时间（通常是37°C，时间根据鲎试剂的说明书而定）。

5. 观察结果：孵育结束后，观察试管中是否出现凝集反应。如果出现凝集，说明供试品溶液中含有细菌内毒素；如果没有出现凝集，则说明供试品溶液中不含有或含量低于检测限。

6. 记录和分析结果：记录实验数据，并根据实验结果判断供试品是否符合细菌内毒素的要求。如果不符合要求，可能需要进一步调查原因并采取相应的措施。

在进行细菌内毒素检查时，应严格遵守相关的法规和指南，如《中国药典》中的相关规定。此外，实验室应具备相应的资质和能力，以确保实验的准确性和可靠性。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

世间始终你好

下面给你一份可直接操作、带有完整计算和示例稀释方案的细菌内毒素（LAL）检测流程。因为你只给了三个关键参数 —— 产品限值 20 EU/件、标准品 10 EU/支、鲎试剂灵敏度 0.25 EU/mL，我将：

• 先把通用原则、公式和注意点说明清楚；
• 再给出两个常见示例（把每件提取到 1 mL 内和提取到 10 mL 内）并把每一步的计算逐位算清楚；
• 最后给出判断标准、常见问题及解决办法。
  

如果你已经有固定的提取体积（mL/件），可以直接用示例里相应部分的公式套算；如果没有，我给出了两种典型提取量（1 mL 和 10 mL）供参考。

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一、基本概念与常用公式（必须理解）

• 产品限值（Units per device）：你给的是 20 EU/件（每件最多允许 20 EU）。
• 要换算成 EU/mL 的产品限值（EL，EU/mL）：
  [
  EL\ (EU/mL) = \frac{\text{每件允许的 EU（EU/件）}}{\text{你用来提取该件的体积（mL/件）}}
  ]
• 最大有效稀释倍数（MVD, Maximum Valid Dilution）：
  [
  MVD = \frac{EL\ (EU/mL)}{\lambda}
  ]
  其中 (\lambda) 是鲎试剂的灵敏度（EU/mL）。MVD 的含义：在该稀释倍数下还能检测到等于产品限值的内毒素；如果对样品稀释超出 MVD，无法证明样品满足 20 EU/件 的限值（即测不到限值水平）。
• 稀释与检测策略：为判断样品是否抑制/增强 LAL 反应，通常要测若干不同稀释倍数（至少 2 个稀释点，一般 1:10、1:50、1:100 等），并在每个稀释倍数做 回收试验（Spike recovery）（即向样品溶液加入已知内毒素量，检查回收率）。回收率常用可接受范围为 50%–200%（不同规范略有差异，以你所适用药典/标准为准）。
  

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二、先做标准品溶液（从 10 EU/支 出发，得到工作标准系列）你有 10 EU/支 的标准品（常见的是每支含 10 EU 干粉）。典型做法：用 10 mL LAL 水溶解该支，得到 1.0 EU/mL 的母液（便于做序列倍比稀释）。下面是一步步的具体操作和计算（体积分配用容易操作的量）：

• 配制母液（Stock）
  
  • 将 10 EU 的标准品溶于 10.0 mL 经过灭热处理的 LAL-grade 水（无内毒素水），充分振荡使完全溶解。
  • 计算：10 EU ÷ 10.0 mL = 1.0 EU/mL（这是母液 S0）。
    
• 做一系列 1:2 连续稀释（推荐点位覆盖 1.0 → 0.0625 EU/mL）
  我建议做点：1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 EU/mL（这些刚好覆盖你的试剂灵敏度 0.25 EU/mL）。具体用法（每步取 1.0 mL + 1.0 mL 无内毒素水）：
  
  • S0 = 1.0 EU/mL（母液）
  • S1（0.5 EU/mL） = 1.0 mL S0 + 1.0 mL water → 体积 2.0 mL，总 EU = 1.0 EU/mL × 1.0 mL = 1.0 EU，浓度 = 1.0/2.0 = 0.5 EU/mL。
  • S2（0.25 EU/mL） = 1.0 mL S1 + 1.0 mL water → 0.25 EU/mL。
  • S3（0.125 EU/mL） = 1.0 mL S2 + 1.0 mL water → 0.125 EU/mL。
  • S4（0.0625 EU/mL） = 1.0 mL S3 + 1.0 mL water → 0.0625 EU/mL。
    

这样你就有一套标准点（1.0 → 0.0625），包含并覆盖试剂灵敏度 0.25 EU/mL。用于定量法做标准曲线或用于凝胶法做阳性对照（PPC）比较。

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三、样品提取、稀释与 MVD 的计算（两例：提取 1 mL/件 与 10 mL/件）我先给公式，然后给逐位计算示例（按你给的数字逐位乘除，避免口算误差）。
公共已知数

• 产品限值：20 EU/件
• 标准品：10 EU/支（上面配出 S0=1.0 EU/mL）
• 鲎试剂灵敏度 (\lambda = 0.25) EU/mL
  

示例 A：提取体积 1.0 mL/件（即把 1 件放入 1.0 mL 提取液中）

• 计算 EL（EU/mL）：
  [
  EL = \frac{20\ \text{EU/件}}{1.0\ \text{mL/件}} = 20.0\ \text{EU/mL}
  ]
  （逐位：20 ÷ 1.0 = 20.0）
• 计算 MVD：
  [
  MVD = \frac{EL}{\lambda} = \frac{20.0}{0.25}
  ]
  逐位算：0.25 × 80 = 20.0，所以 20.0 ÷ 0.25 = 80。
  → MVD = 80（意味着你最大可以做到 1:80 的稀释倍数仍然能检测到与限值等量的内毒素）
• 检测稀释设计（建议）：应在 MVD 以内选择 2–4 个稀释倍数来检验抑制/增强，典型组合：1:10、1:25、1:50（1:50 < 80，安全）。同时在这些稀释倍数上做回收（spike）。
  
  • 例如做测定的最终反应体系每孔为 0.1 mL（或按你方法）。下面给出把样品提取液做到这些稀释的操作示例（假设操作方便以 1 mL 为单位）：
    
  如何配制样品溶液（以原始提取液记为 Sample Extract, SE）：
  
  • 1:10：取 0.1 mL SE + 0.9 mL LAL 水 → 总体积 1.0 mL（结果是 1:10 的稀释）
  • 1:25：取 0.04 mL SE + 0.96 mL LAL 水 → 体积 1.0 mL（更精准可用微量移液器：40 μL + 960 μL）
  • 1:50：取 0.02 mL SE + 0.98 mL LAL 水 → 20 μL + 980 μL（或 100 μL SE + 4.9 mL &#8658; 1:50）
    
  注意：做稀释时务必用无内毒素容器和 LAL 水，且每一步都要涡旋混匀并在冰上或室温短时间内完成（按方法）。
• Spike（回收）设置（示例）：
  
  • 选择一个 spike 濃度（常用的是使检测终体积中内毒素为 0.25 EU/mL 或 0.5 EU/mL，便于判断）。常见做法：用你配好的 S2（0.25 EU/mL）作为 spike 溶液源，向样品稀释液中加入 1 体积的 spike 溶液（或按需要计算）。
  • 比如：在 1:50 的样品溶液中再加入 0.1 mL 的 0.25 EU/mL 标准溶液到 1.0 mL 体系中，计算回收时要减去样品原有内毒素的贡献并按公式算回收率。
  • 回收率接受范围：50%–200%（以所适用药典为准）。
    

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示例 B：提取体积 10.0 mL/件（把 1 件放入 10 mL 提取液）

• 计算 EL（EU/mL）：
  [
  EL = \frac{20\ \text{EU/件}}{10.0\ \text{mL/件}} = 2.0\ \text{EU/mL}
  ]
  （20 ÷ 10.0 = 2.0）
• 计算 MVD：
  [
  MVD = \frac{2.0}{0.25} = 8.0
  ]
  （逐位：0.25 × 8 = 2.0，所以结果 8）
  → MVD = 8（最大稀释 1:8）
• 检测稀释设计（建议）：由于 MVD 只有 8，稀释选择受限。建议测 1:2、1:4、1:8（并在每个点做回收）。如果样品在这些低稀释倍数就显著抑制/增强，可能需要改变提取体积或采用不同的试验方法（例如用更高灵敏度的试剂或改进样品处理以减少抑制因子）。
  样品稀释配制示例（以 SE 为原提取液）：
  
  • 1:2：0.5 mL SE + 0.5 mL LAL 水 → 1.0 mL 总量
  • 1:4：0.25 mL SE + 0.75 mL LAL 水 → 1.0 mL
  • 1:8：0.125 mL SE + 0.875 mL LAL 水 → 1.0 mL（125 μL + 875 μL）
    

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四、凝胶法与定量法（步骤概要）下面给出典型的实验步骤，按你可能使用的两类最常见检测法：凝胶凝固法（gel-clot）与比色/浊度定量法（chromogenic/turbidimetric）。你可据所用试剂盒选择对应流程。
A. 试验前准备（通用）

• 使用 LAL-grade（无内毒素）试剂水、容器、移液器枪头（无内毒素处理/专用）。
• 将所有试剂复温至实验室温度（按试剂说明），但是切勿超时暴露。
• 空白（水对照）、阴性对照（LAL 水）、阳性对照（标准品不同浓度）、样品稀释组、样品稀释组的 spike（加标准品）都要准备好。
• 每个条件建议做重复（凝胶法至少 2 重复；定量法建议 3 重复以求统计可靠）。
• 记录每一孔/试管的体积与稀释倍数。
  

B. 凝胶凝固法（Gel-clot，常用于放行判断）

• 在无内毒素试管或凝胶板上按体积顺序加入：样品稀释液或标准溶液（例如 0.1 mL）。
• 加入 LAL 试剂（体积按试剂说明，典型为 0.1 mL），轻轻混匀，立刻孵育（通常 37 ℃ ± 1 ℃，按试剂要求温度与时间，常为 60 min）。
• 孵育结束后，倒置试管（或按说明观察）1 分钟：若形成凝胶且不溶解，视为“凝结阳性”。
• 判定：在所选稀释倍数中，若样品不凝结且同稀释的 spiked 样品凝结（并且回收率在可接受范围），则该稀释点无抑制/增强，可用该点判定。若样品与 spiked 均不凝结，说明抑制存在（需要更低稀释或去抑制处理）。
• 用 MVD 判断：需保证你测试的稀释倍数中至少有一个稀释倍数 ≤ MVD 并满足回收（或无抑制），才能证明合格。
  

C. 比色/浊度定量法（用于给出 EU/mL 精确值）

• 在酶标板按顺序加入标准系列、空白、样品稀释（每点 3 重复）。
• 加入试剂，按仪器程序在规定波长/时间点读数，得到标准曲线（OD vs EU/mL 或时间阈值 vs EU/mL）。
• 根据标准曲线算出样品在测定稀释下的 EU/mL，然后换算回 每件 EU（乘以提取体积和稀释倍数）以判断是否 ≤ 20 EU/件。
• 做 spike 回收并计算回收率：
  [
  \text{回收率(%)}=\frac{(\text{测得的带 spike 样品浓度} - \text{测得的未加 spike 样品浓度})}{\text{加的 spike 浓度}} \times 100%
  ]
  

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五、具体数值计算举例（把定量和回收都算清楚）继续用 示例 A（提取 1 mL） 并给出一个完整数值流程示范，便于直接上手。

• 提取体积 = 1.0 mL/件
• 原始提取液（SE）的浓度表示：如果样品中真实内毒素为 X EU/件，则 SE 中内毒素浓度 = X EU/mL（因为 1 mL 提取），待测目标是证明 X ≤ 20。
• 假设你做 1:50 的稀释（见上），在该稀释下测得浓度为 C_meas (EU/mL)（这是检测体系返回的浓度，已经是稀释后的浓度），则回算到原提取液：
  [
  C_{\text{原}} = C_{\text{meas}} \times \text{稀释倍数}
  ]
  然后换算到 每件（提取体积 1 mL）：EU/件 = ( C_{\text{原}} \times 1.0\ \text{mL} ) = ( C_{\text{meas}} \times \text{稀释倍数} \times 1.0 )
  

回收计算示例（数值）：

• 设在 1:50 稀释下，未加 spike 的测定结果 C_unspiked = 0.02 EU/mL（稀释后浓度），带 spike（加入 0.1 mL 0.25 EU/mL 标准到 1.0 mL 总量，相当于加入 0.025 EU 总 => 0.025 EU / 1.0 mL = 0.025 EU/mL 的 spike）测得 C_spiked = 0.043 EU/mL。
• 计算回收：
  [
  \text{回收} = \frac{0.043 - 0.02}{0.025} \times 100% = \frac{0.023}{0.025} \times 100% = 92%
  ]
  92% 在 50%–200% 接受范围内，说明该稀释点无显著抑制/增强，可以用该点数据。
• 原始样品浓度回算：C_unspiked × 50 = 0.02 × 50 = 1.0 EU/mL → EU/件 = 1.0 EU（远低于 20 EU/件，合格）。
  

注意：上面的数值（0.02、0.043）是示例；你实际测得的 C_meas 来自检测仪/比色读数。

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六、实验记录与判定要点（checklist）

• 每次实验都记录：提取体积、样品批号、稀释倍数、标准品批号与配置方法、LAL 试剂批号与灵敏度、温度、孵育时间。
• 确保至少有一个稀释点同时满足：稀释倍数 ≤ MVD 且 spike 回收在 50%–200%（或按你适用规范）。只有满足此条件才可用该点的数据判定产品是否 ≤ 20 EU/件。
• 若所有稀释点均显示抑制（即 spiked 也不回收或回收率不合格），需要：进一步稀释样品（前提不能超过 MVD），或改变提取方法/处理样品（去除抑制因子），或使用不同灵敏度的试剂。
  

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七、常见问题与解决建议

• 样品抑制（spike 回收低于 50%）：常见于含有金属离子、有机溶剂、蛋白、表面活性剂等。处理办法：
  
  • 增大稀释倍数（在 MVD 范围内）；
  • 更换提取溶媒（必要时用 0.1% Tween-20 的 LAL 水，但注意对试剂兼容性）；
  • 使用对 β-葡聚糖不反应的 LAL（或使用 β-葡聚糖抑制剂）如果怀疑为真菌β-葡聚糖干扰。
    
• 回收过高（>200%）：可能是样品自身含有激活因子或标准品配置/加样错误，检查操作和标准品。
• MVD 很低（例如示例 B 的 MVD=8）导致检测窗小：可考虑减少提取体积（如果可行且符合规范/代表性），或采用更高灵敏度的试剂（λ 更小）或改进样品清理。
  

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八、最后给你一份快速操作步骤模板（可直接套用）

• 准备：LAL-grade 水；灭热处理容器；移液器；鲎试剂（λ=0.25 EU/mL）；标准品 10 EU/支。
• 配制标准系列：10 EU/支 → 溶于 10.0 mL 水 → S0=1.0 EU/mL；按 1:2 连续稀释得到 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 EU/mL。
• 样品提取：将 1 件产品按既定体积（示例：1.0 mL 或 10.0 mL）进行摇匀/提取，记录体积。
• 计算 EL 与 MVD：按第二区公式计算；选择检测稀释点（不少于 2 个，并且至少一个 ≤ MVD）。
• 配制样品稀释：按选择的稀释倍数配制（每步用无内毒素器材）；为每个稀释点做未加 spike 与加 spike（如用 0.25 EU/mL 的标准稀释液做 spike）。
• 按试剂说明进行凝胶法或定量法检测。
• 数据处理：若为定量法，求标准曲线，计算样品稀释后浓度，回算到 EU/件。计算回收率并判定。
• 记录与判定：只有在至少有一稀释点满足（稀释倍数 ≤ MVD 且 spike 回收合格）时，方可按该点数据判定产品是否合格（≤ 20 EU/件）。