职场小白求助

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方法开发需要做哪些工作呀，求指导

gzgz

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什么的方法开发？对象？仪器？工艺？还是分析？

wzzz2008

gzgz 发表于 2025-11-18 10:12
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方法开发是药学和医疗器械领域的重要环节，涉及多个关键步骤。以下是一些基本要求：

1. **文献调研**：查阅相关文献，了解当前的研究进展和技术标准。

2. **设计开发策划**：根据临床需求制定详细的开发计划，确保项目目标明确、资源合理配置。

3. **输入与输出确定**：明确开发过程中的输入条件和预期输出结果，确保开发过程可控。

4. **验证与确认**：通过实验验证开发方法的有效性和可靠性，确保其符合相关法规和标准。

5. **风险管理**：识别并管理开发过程中的潜在风险，确保安全性和合规性。

6. **持续改进**：根据反馈不断优化开发方法，提升其性能和适用性。

以上步骤需严格遵循相关法规和指南，如ISO 13485:2016等。希望这些信息能对你有所帮助。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

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6程序Procedure
6.1        分析方法开发前的准备工作
6.1.1        分析人员向工艺人员（外购原料药时，向原料供应商）索要原料药的合成路线（至少两步）和杂质谱及杂质对照品信息，明确分析方法开发的目的和目标。
6.1.2        进行文献检索，获取药物分析方法开发的起点的色谱条件。
如果待测物为仿制药，应首先查询待测药物是否被EP\USP\JP\BP\CP等药典收载，是否有进口药品注册标准。药典或进口药品注册标准上的分析方法是很好的分析方法开发或优化的起点。
如果待测样品为创新药或无官方质量标准的，可通过查找药物本身或同系列化合物的分析方法文献资料，以获取有用的分析方法开发起点信息色谱条件，无法查询到有用的分析方法参考资料时，可按下文推荐的起始条件进行预试验。
6.1.3        了解待测化合物的信息，选择分离模式。根据待测化合物的化学结构官能团，pKa，分子量大小，UV吸收光谱、稳定性、溶解度等情况，选择通过液相色谱法或气相色谱法进行化合物与有关物质的检测。
通常，气相色谱法主要适用于检测化合物（游离态）的沸点低于300摄氏度且没有紫外吸收的样品的有关物质，液相色谱法应用范围更广，适用于大多数化合物的有关物质检测。
在确定使用液相色谱法的前提下可按照下图1选择分离模式。通常，HPLC-UV模式是化合物有关物质分析方法的首选。
图1 液相色谱法分离模式的选择

6.2有关物质HPLC分析方法的建立的流程图


6.3试验样品和样品溶解剂的选择
6.3.1试验样品的选择
6.3.1.1在杂质对照品可以获得时：
以样品和杂质对照品的混合物作为分析方法开发的试验样品。
        6.3.1.2在杂质对照品不能获得时：
分析人员根据合成人员给出的杂质谱中的各杂质化学结构信息，选取含与主峰最难分离的杂质（通常为位置异构体或非对映异构体或与API结构十分相似的杂质）的样品作为分析方法开发的样品。
分析方法开发试验样品通常为API与杂质的混合溶液，或API的粗品，或（和）代表批次的API，或API\制剂的降解样品(和制剂辅料空白)。
6.3.2样品溶解剂（稀释剂）的选择
6.3.2.1分析方法开发的初期，可根据API在水、甲醇和乙腈中的溶解度情况，选择水与甲醇或乙腈的混合物作为样品的溶解剂（需要注意观察样品在溶解剂的稳定性）。
6.3.2.2选择样品溶解剂的原则顺序是：
样品在溶解剂中稳定性较好及样品中的杂质能在溶解剂充分溶解
经济和环保方面的考虑（水、甲醇、乙腈，在价格和毒性方面依次增加）
一般不建议使用纯有机溶剂作为样品的溶解剂，因纯有机溶剂作为样品的溶解剂在进样量大于10ul时，易产生溶剂效应，导致主峰前沿或峰形变差，或甚至在色谱系统的死时间内部分洗脱出。
6.3.2.3分析方法开发的后期，分析方法的流动相为样品溶解剂的首选。
6.3.3色谱柱的选择
        色谱柱是决定药物及杂质间分离度的关键因素之一。影响色谱柱性能的参数有：
（1）        色谱柱填料基质硅胶的纯度
硅胶纯度和残留金属离子浓度，硅胶的杂质会影响化合物的峰形，硅胶表面的金属含量高会影响碱性化合物的峰形，易发生拖尾。
（2）        色谱柱尺寸填料床的长度和内径
增加色谱柱长度，可以在一定程度上提高柱效，但也会升高压力和导致峰展宽；宽柱径，提高载样量，但也会增加横向扩散，同样会导致峰展宽。窄柱径可以节约溶剂，可减少横向扩散，但压力相对较大。
（3）        填料颗粒形状及粒径
球形颗粒柱效高、重现性好、柱床结构均匀，不规则形柱床结构不均匀、流动相线速度不均匀，容易谱带展宽；平均颗粒直径，粒径越小，柱效越高，柱压也越高，对色谱系统的耐压要求越高。
（4）        填料颗粒的表面积
表面积越大，保留时间增加（有利于提高分离度）， 载样量增加，需要的平衡的时间增加。而低表面积能更快达到平衡状态，且更耐污染。
（5）        填料颗粒的孔径
颗粒的孔或腔的平均尺寸，范围是80~300Å，大孔径的填料颗粒可以延长大分子溶质在填料表面的滞留时间，改善分离，所以大孔径填料适合分离大分子化合物或待分离组分较多的化合物。
（6）        键合相
不同类型键合相的色谱柱选择性差异较大，常用的键合相有C18、C8柱、苯基、氰基、氨基键合相色谱柱。
（7）        载碳量
通常，反相色谱柱含碳量越高，硅胶上键合有机相越多，溶质的K（容量因子）值越大，保留越强，分离度越高。但同时，保留强也可能造成峰扩散或拖尾导致的分离度降低。
（8）        封端
硅胶键合相填料中有部分未封端的残留硅羟基，封端（见图2）可以减轻待测组分与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应，改善保留和峰形，这对于碱性化合物尤其重要。不封端时，提高了硅羟基的影响，增强了极性物质的保留。
图2  封端的C18键合相填料

（9）        键合类型
相同键合相 的C18柱，内嵌入不同的基团（不同键合类型见图3），选择性和疏水性差异也很大。以市场上常用的Waters C18 柱为例，讲述不同键合类型的C18色谱柱的特点和适用范围，见表1 。
表1  常用的Waters 色谱柱的适用条件
不同键合类型的品牌        pH
范围        使用温度(℃)范围        100%
水相        封端        色谱柱特点和适用化合物类型
Symmetry
Shield RP C18        2-8        45       
Yes
        Yes        适用化合物范围广，价格相对低廉，Waters最畅销的色谱柱。
Xbrige C18
(BEH)        1-12        80(低pH时)
60(高pH时)        No        No        宽pH和温度使用范围，适用于需要在高pH流动相条件的碱性化合物的分析
Xbrige Shield RP 18(BEH)        2-11        50(低pH时)
45(高pH时)        Yes        Yes        宽pH范围、适用于碱性且极性较大的化合物。
Xselect CSH
C18        1-11        80(低pH时)
45(高pH时)        No        Yes        Wasters第二代杂化颗粒填料色谱柱，表面带电杂化颗粒（CSH）技术和高强度硅胶颗粒（HSS）技术，强酸性条件下性能稳健。适用于需低pH流动相的化合物。
Xterra MS C18        1-12        60        No        Yes        宽pH范围，在流动相含盐浓度低时依然有较好的峰形，利于兼容LCMS分析
Atlantis T3(C18)        2-8        45        Yes        Yes        采用三官能团C18烷基键合相，保留极性化合物首选适用于强极性的小分子化合物，如有机酸



图3 键合极性基团的C18键合相

（10）        市场上不同厂家不同品牌的83种不同类型的色谱柱的选择性和疏水性对比图。
     图4 不同类型的色谱柱的选择性和疏水性对比图

查询网址：http://www.waters.com/waters/promotionDetail.htm?id=10048475&locale=zh_CN
6.3.4流动相的选择
6.3.4.1对于反相色谱，常用的有机相为甲醇、乙腈、四氢呋喃（注意：四氢呋喃对peek管线有一定的腐蚀作用，所以四氢呋喃在有机相的比例一般不超过10%）。
6.3.4.2水相通常为缓冲盐溶液，常用的流动相的缓冲溶液的pKa、缓冲范围和紫外截止吸收波长见表2，常用的流动相的有机相的溶剂强度关系见表3和表4。

表2  常用的流动相的缓冲溶液的冲范围和紫外截止吸收波长
缓冲剂        pKa        缓冲范围        UV截止波长（nm）
三氟乙酸        >2        1.5-2.5        210(0.1%)
H3PO4/ K2HPO4/ KH2PO4        2.1        1.1~3.1        200(0.1%)
        7.2        6.2-8.2       
        12.3        11.3-13.3       
柠檬酸/柠檬酸三钾        3.1        2.1-6.4        230(10mM)
        4.7               
        5.4               
甲酸/甲酸铵        3.8        2.8-4.8        210(10mM)
乙酸/乙酸铵        4.8        3.8-5.8        210(10mM)
K2CO3/KHCO3        6.4        5.4-7.4        200(10mM)
        10.3        9.3-11.3        200(10mM)
氯化铵/氨水        9.2        8.2-10.2        200(10mM)
三乙胺盐/三乙胺        11.0        10.0-12.0        200(10mM)
（注意：流动相的pH须在色谱柱使用的pH范围之内）

表3  甲醇-水与乙腈-水的等溶剂强度混合物
%ACN        %MEOH        %ACN        %MEOH
5        7        55        65
10        14        60        70
15        21        65        74
20        28        70        78
25        34        75        82
30        40        80        86
35        45        85        90
40        50        90        95
45        55        95        98
50        60        100        100

表4  用阴离子对试剂（如烷基磺酸盐）的HPLC中溶剂强度关系（百分比）
甲醇        乙腈        四氢呋喃
0        0        0
10        3        1
20        8        4
30        13        8
40        19        14
50        25        21
60        32        30
70        39        （40）b
80        （46）        （51）
90        （53）        （64）
100        （60）        （78）
a：例如，若20%甲醇可获得较好的保留范围（0.5<k<20），则8%乙腈或4%四氢呋喃应具有相近的运行时间。
b：近似值
6.3.5检测波长的选择
6.3.5.1通过光电二极管整列检测器（DAD）对药物和杂质的对照品进行紫外光谱扫描，选取主要成分和杂质均有较强吸收的波长作为样品的检测波长。
6.3.5.2当主峰和杂质的最大吸收波长相差较大时，选取各杂质校正因子相对接近于1.0的吸收波长为药物的检测波长。

6.3.6流速的选择
典型的流速是1.0ml/min .可在1.0 ~ 2.0 ml/min 范围内筛选合适的流速。提高流速时需要注意色谱柱压力情况。流速越高，压力越大。
6.3.7建议的首次HPLC分离条件
建议的分离条件见表5，采用梯度洗脱的模式，分析时间约为30分钟。
表5  首次HPLC分离的实验条件
分离条件        较好的首要选择
色谱柱        /
尺寸（长度，内径ID）        15*0.46cm
粒度        5um 或3.5um
固定相        C8或C18
流动相        /
溶剂A和B        磷酸盐缓冲液-乙腈/甲醇
%B        20~80%a
缓冲液（化合物、pH、浓度）        10mM磷酸钾，2.0≤pH≤3.0b
添加剂（如胺改性剂、离子对试剂c）        开始时不用
流速        1.0mL/min
柱温        35℃
样品量        /
体积        ≤20uL
载样量        ≤100ug
a：用于初始梯度有机相的最低和最高比例。
b：中性样品不需要缓冲液。
c：常用的阴离子对试剂有：烷基（C5~C12）磺酸钠、全氟戊酸、高氯酸、六氟磷酸等。常用的阳离子对试剂有：四丁基氢氧化铵、四丁基硫酸氢铵、四丁基氯/溴化铵等
6.3.8样品溶液稳定性的考察
对样品溶液的稳定性进行考察，确保样品在检测过程中没有发生降解。
&#61656;首先在室温条件下对样品溶液的稳定性考察，通常用样品溶液新鲜配制的样品溶液作为测试溶液，根据试验方法条件下，分别于0h、6h、12h、24h、48h取样进行检测。
&#61656;在溶液稳定性考察时，同时要注意光照的影响（样品溶液的光稳定性需要单独进行考察）。
&#61656;在预定的稳定性期间内，样品溶液应与新鲜配制的溶液相比，主峰纯度基本不发生变化和没有新杂质生成。当有明显杂质生成时，将样品溶液温度设为8℃（或更低）重新进行考察。
6.3.9强制破坏预试验
6.3.9.1药物的分析方法需具备稳定性指示功能，在具备对工艺杂质的检测能力的同时，也需要具备对降解杂质的检测能力。
6.3.9.2一般的强制降解条件如下表6（每类降解条件均需要一个控制样品进行对比），破坏的具体条件需根据样品稳定性情况摸索后确定，一般样品降解程度应在在5%-15%，并通过光电二极管阵列检测器（DAD）检查主峰的纯度因子，各破坏条件下主峰的纯度因子不低于980。
表6  强制破坏预试验条件
高温        70℃下放置7天
高湿        25℃,90%RH，放置7天
或样品的水溶液在25℃放置7天
强白光*        总照度不低于1.2×106Lux·hr
紫外光*        能量不低于200w·hr/m2
酸        0.1N HCl中室温放置24h
碱        0.1N NaOH中室温放置24h
氧化        3%双氧水中室温放置24h
*：可用同时具有强白光和紫外光强制降解条件的仪器下放置的样品，代替分别在强白光强制降解条件的仪器下放置和紫外光强制降解条件的仪器下放置的样品。若双重条件下降解过快，需要重新分开进行实验。
6.3.9.3上述表格中强制降解的试验条件仅供参考，不同样品在进行强制降解时样品状态（固态或液态）、破坏条件、降解程度的具体要求应根据实际情况确定。
6.3.10强制破坏预试验
药物的分析方法需具备稳定性指示功能，在具备对工艺杂质的检测能力的同时，也需要具备对降解杂质的检测能力。
6.3.11分析方法的优化
为了改善分离度，通常采用以下色谱条件（见表7）进行分析方法的优化。
表7  反相HPLC中，能用于改变选择性（α）的色谱条件（从实验1改为实验2）
条件a        示例
        实验1        实验2
改变%B（所有）        40% 乙腈        50% 乙腈
改变有机溶剂（所有）        40% 乙腈        50% 甲醇
混合有机溶剂（所有）        40% 乙腈        20%乙腈+25%甲醇
改变洗脱梯度           20%~60%乙腈          20%~50%乙腈
改变柱温        35℃        50℃
改变流速        1.0        1.5
改变pH（离子）        pH2.5        pH3.5 or 4.5
改变离子对试剂浓度（离子）        无试剂        10mM六氟磷酸钾
改变缓冲液或缓冲液浓度（离子）        10mM磷酸盐缓冲液        0.1% 三氟乙酸缓冲液
改变色谱柱的长度（或填料内径）         150cm (5um)         250cm (3um)
改变不同品牌的色谱柱         Symmetry
Shield RP C18        Xbirge shield C18 or PFP
a：“所有”指该条件中性与离子样品均可用；“离子”指该条件仅对含有离子或可电离的样品有效。
6.3.12已知杂质的校正因子测定
已知杂质的相对校正因子（f）是通过比较药物对照品与杂质对照品在相同浓度时的响应值得到的，它反映了药物主成分和杂质在检测波长下的紫外吸收差异。杂质的相对校正因子f的计算公式说明如下：
&#61656;杂质的校正因子f=药物主要成分对照品的线性斜率/杂质对照品的线性斜率
&#61656;若杂质的校正因子计算值在0.2-5之间，可以采用自身对照法加校正因子用于杂质的定量计算；若杂质的校正因子小于0.2或大于5，需使用外标法定量检测杂质或特定的检测波长检测杂质；若杂质的校正因在0.9-1.1之间，无需加校正因子计算杂质；对于未知杂质，校正因子默认为1。

6.3.13分析方法的对比研究
更新分析方法时，需要对新老分析方法进行对比研究并通过具体的实验数据说明新的分析方法的优越性。通常以主峰与杂质间的分离度、杂质与杂质间的分离度、样品中被检测出的杂质量和杂质个数及对未知杂质的检测灵敏度来说明新的分析方法的优越性。
6.3.14分析方法的LCMS确认
对代表批次的样品进行LCMS 分析，HPLC部分条件和选定的HPLC的色谱条件相同或类似，查看主峰和各已知杂质在质谱条件下里是否含有不能解释的准分子离子峰或碎片离子峰，以确认HPLC条件下各峰（主要是主峰）是否有包峰的情况。
和LCMS兼容的HPLC的水相流动相有三氟乙酸溶液、甲酸（或甲酸铵）溶液、乙酸（或乙酸铵）溶液、碳酸氢铵溶液等挥发性或在高温下可分解的缓冲盐溶液。
6.3.15分析方法的预验证
6.3.15.1在分析方法确定下来后，对分析方法进行预验证，以发现可能存在的问题，并及时解决，从而确保分析方法验证的顺利通过。
6.3.15.2预验证项目有：
（1）        系统适用性
系统适用性是通过检测方法在系统里表现的性能达到可接受标准来评估方法的有效性。按照分析方法，进样空白溶液、连续6针系统适应性溶液（主成分和杂质对照品混合溶液），要求连续6针系统适应性溶液中各峰面积相对标准偏差（RSD）不得过5.0%，保留时间相差不得过0.5 min。
（2）        滤膜吸附试验 （只针对于需要过滤的制剂样品）
滤膜吸附试验主要是为了考察不同厂家、不同粒径的滤膜和不同过滤体积对主成分含量的影响。以离心后的上清液含量为100%，通过不同的过滤操作，考察滤液的含量，确保滤膜对杂质含量的测定无干扰。以离心后的上清液含量为100%，续滤液的回收率应在98%~102%。
（3）        专属性
专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能有效的分离被测物的能力。按分析方法条件分别进样空白溶液、空白辅料、杂质定位溶液和分离度溶液、和样品溶液，考察主峰与相邻的色谱峰及杂质峰之间的分离度情况。要求空白无干扰，分离度溶液中峰的最小分离度不小于1.5，样品中各杂质报告的杂质峰之间的分离度不小于1.5。
（4）        定量限(LOQ)、检测限(LOD)
信噪比为10的为定量限，信噪比为3的为检测限。将主峰和各杂质对照品溶液稀释为0.1%（对于制剂）和0.05%（对于原料药），进样此溶液计算信噪比。LOQ溶液的信噪比不得小于10，检测限的信噪比不得小于3。
（5）        精密度
按分析方法，配制6份供试品溶液，计算6份供试品杂质含量结果间的RSD%，RSD%不得过5.0%。
（6）        准确度
按分析方法配制9份样品溶液，分别加入LOQ~120% 至少三个不同浓度的杂质对品品溶液，每个浓度水平对照品配样3份，计算9份样品测得的回收率和平均每个浓度水平的平均回收率和总回收率（回收率=杂质测定结果/实际加入量的比值）。要求回收率均在90.0%~110%之间。
（7）        线性范围
按照分析方法条件，配制杂质对照品成LOQ ~ 120%浓度溶液，每份样品进样2次，按平均值计算五个浓度水平溶液的线性。线性相关系数R不得小于0.98。
（8）        耐受性
按照分析方法，分别改变柱温、流速、流动相pH或缓冲盐的浓度和用不同批号的色谱柱考察分析方法的耐用性，（具体考察项目和改变范围以见分析方法色谱条件为准）。根据耐受性试验结果指出影响分析方法性能的关键影响因素。
6.4分析方法开发报告
6.4.1分析方法成功开发后，应对开发过程进行记录和总结，并起草分析方法开发报告（AMD-X-#R）。
AMD：代表分析方法开发
X：代表项目编号
#：为数字，代表不同的方法（如含量、杂质、异构体等）
R：代表报告
6.4.2方法开发报告一般有以下内容，具体根据实验项目实际而定：
（1）原方法
（2）优化后方法
（3）优化后方法的优势与对比
（4）优化后方法专属性实验结果
（5）优化后方法LOQ/LOD结果
（6）优化后方法稳定性结果
（7）其他预验证项目

环湖

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