怎么算确定了一个样品细菌内毒素的检测方法？

anpugongying

如题，怎么算是确定了一个细菌内毒素的检测方法？
1、如果是确定了供试品制备，稀释度和灵敏度就算确定了一个方法的话，那么如果L是0.5，选择稀释两倍用0.06的鲎试剂做的干扰实验也通过了，后续用这个方法检测就行，但是某一次检测，2倍显示供试品凝了，可以稀释到8倍直接检测吗？若可以，那2倍0.06鲎试剂的干扰实验有什么意义；若不可以，这次重新做8倍干扰，通过了，但是，这不是方法就变了吗？
2、凝胶半定量实验，L为0.5，确定了最小不干扰稀释倍数为2倍，则可以用0.03的鲎试剂做半定量，稀释4,8,16倍做半定量。那越稀释越干扰的样品怎么做半定量？那么这个样品是可以用4,8,16倍直接检测的吗？是不是说明稀释倍数确定了方法就确定了？
3、2017年的《中国药典分析检测技术指南》写干扰实验是在已有内毒素检测方法的样品出现了干扰，试验室采用了比较特殊的处理方法后，希望验证该方法是否可以有效的排除干扰时使用，是否说明存在一个样品的稀释倍数和鲎试剂都经过确认了，但是，三年后同样工艺的一批样品却不能用这个稀释倍数和鲎试剂却干扰了的情况呢？这种情况，直接重新做干扰实验，证明样品内毒素含量确定就可以吗？
4、2017年的《中国药典分析检测技术指南》中还写到：共6种方法，如果在品种的各论项下没有规定使用哪种方法，则可以使用其中任何一种进行检验。品种的各论下几乎都是写的取本品，依法检查（11432）每1ml样品种含内毒素的量不得过多少EU,那么是不是同一个项目的不同稳定时期的样品可以用不同稀释度和不同鲎试剂检测呢（每次都做干扰实验）？

anpugongying

第一次发帖子，竟然没人回复

阿容

针对问题1：药典是有明确指示，在不超过MVD的情况下需继续稀释检测。那些情况需重做干扰药典也有说。另外，因样品，试剂本身会有一些系统误差，所以不可能做了一次干扰就就是那个稀释度不变了。

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anpugongying

好迷茫啊

山顶洞人

anpugongying 发表于 2020-2-23 14:52
第一次发帖子，竟然没人回复

周末啊，你别急啊，我给你高亮一下，这个我也不太熟悉。

凡9731cacf

两倍的稀释是不是该物品的最大稀释倍数？干扰试验时用了几种鲎试剂及几个批次的样品？鲎试剂做过灵敏度试验没？8倍稀释度做过干扰试验没？

anpugongying

山顶洞人 发表于 2020-2-23 15:30
周末啊，你别急啊，我给你高亮一下，这个我也不太熟悉。

谢谢，这几个问题困扰我好久了

anpugongying

leibihua 发表于 2020-2-24 07:37
针对问题1：药典是有明确指示，在不超过MVD的情况下需继续稀释检测。那些情况需重做干扰药典也有说。另外， ...

1、您说的可以重新做干扰的是说的鲎试剂，检测环境，工艺等可能影响检测的那几个情况吗?那不同批号的鲎试剂，算鲎试剂变化吗？
2、您说不可能做了一次干扰那个稀释倍数就不变了，但是如果变了，还算同一个方法吗？

anpugongying

凡9731cacf 发表于 2020-2-24 07:57
两倍的稀释是不是该物品的最大稀释倍数？干扰试验时用了几种鲎试剂及几个批次的样品？鲎试剂做过灵敏度试验 ...

第一次做干扰用的2倍做的，方法通过了，干扰是用的两个厂家的鲎试剂，3批样品，因为某一次用两倍检测样品不合格，（2倍不是最大稀释倍数），所以想稀释到8倍（最大稀释倍数检测，也做了干扰试验），但是，想着这第二次检的方法和第一次检测方法，算是同一种吗？

火舞精灵

看看预实验，采用市面上最高灵敏度的鲎试剂0.03，然后选择干扰试验的浓度或稀释倍数，选择适合公司产品相适应的鲎试剂，可以进行干扰试验了，如果选择的浓度或稀释倍数都有干扰，可以采用更高的稀释倍数或采用更高灵敏度的鲎试剂，干扰试验通过了，你可以得到一个最大不干扰浓度，当然根据选择的是限度和鲎试剂灵敏度，最大稀释倍数也是有的，有了这些数据，你就不迷糊了，希望对你有帮助。

anpugongying

火舞精灵 发表于 2020-2-24 10:28
看看预实验，采用市面上最高灵敏度的鲎试剂0.03，然后选择干扰试验的浓度或稀释倍数，选择适合公司产品相适 ...

我最迷茫的是，2倍0.25和4倍0.125算两种方法吗？限值是0.5的情况下？

火舞精灵

只要不超过最大不干扰浓度，不超过最大稀释倍数都是可以的，这也是验证的目的，验证会有一个最大不干扰浓度，也就是说只要不超过这个浓度都是可以的

anpugongying

火舞精灵 发表于 2020-2-24 10:56
只要不超过最大不干扰浓度，不超过最大稀释倍数都是可以的，这也是验证的目的，验证会有一个最大不干扰浓度 ...

您的意思是，只要符合要求，我同一个项目的不同时期，比如稳定性12月和24月，可以用不同稀释倍数和不同灵敏度的鲎试剂检查吗？只要我每次都做干扰试验，且通过？

山顶洞人

anpugongying 发表于 2020-2-24 10:12
谢谢，这几个问题困扰我好久了

不客气，你这样的发问是需要鼓励的！

歪说歪有李

等等，你问题比较多，我在word整理完回复你。

凡9731cacf

anpugongying 发表于 2020-2-24 10:16
1、您说的可以重新做干扰的是说的鲎试剂，检测环境，工艺等可能影响检测的那几个情况吗?那不同批号的鲎试 ...

1、产品任何因素的改变都要重新做干扰试验。不同批次的鲎试剂要重做灵敏度试验
2、方法和稀释倍数？

anpugongying

凡9731cacf 发表于 2020-2-24 12:46
1、产品任何因素的改变都要重新做干扰试验。不同批次的鲎试剂要重做灵敏度试验
2、方法和稀释倍数？

同一个样品，可以在不同时间，用不同灵敏度的鲎试剂和相应的最大稀释倍数检查吗？（鲎试剂已做灵敏度复核，且通过，不同鲎试剂和稀释倍数都是做了干扰试验的）。我不确定的主要问题是，不同稀释倍数和相应的鲎试剂，算一个样品的两个检测方法吗？

anpugongying

vabs（李） 发表于 2020-2-24 11:55
等等，你问题比较多，我在word整理完回复你。

好，谢谢，等您消息

歪说歪有李

如题，怎么算是确定了一个细菌内毒素的检测方法？
总体回答：在对鲎试剂做完灵敏度复核、确保工作标准品来源可靠/示值有效的基础上，按照药典通则或者红皮书完成干扰试验，形成SOP，就确定了一个细菌内毒素的检测方法。

1、如果是确定了供试品制备，稀释度和灵敏度就算确定了一个方法的话，那么如果L是0.5，选择稀释两倍用0.06的鲎试剂做的干扰实验也通过了，后续用这个方法检测就行，但是某一次检测，2倍显示供试品凝了，可以稀释到8倍直接检测吗？若可以，那2倍0.06鲎试剂的干扰实验有什么意义；若不可以，这次重新做8倍干扰，通过了，但是，这不是方法就变了吗？
答：基础的公式 MVD=cL/λ。按你的标准，c单位为EU/ml，c=1；MVD=8。这些都正确。
但是不要片面理解MVD。要通过在该灵敏度的鲎试剂条件下，确定出一个不超过MVD且没有干扰的最小稀释倍数作为检测稀释方法。这是药典的要求，否则要重做干扰试验（任何情况下都不要超过MVD）。理论上可以，但是需要后补做干扰试验，因为可能的影响因素比较多。需要做当前稀释倍数的干扰试验的原因是你方法学时候的实验基础和你改变稀释倍数后的实验基础不一样。如实际鲎试剂的灵敏度、标准品的实际内毒素载量、检查用水的实际本底等，需要按规定的方法再次进行过干扰试验（具体方法见红皮书）。

根据药典“当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。”，你的可能的变量疑虑是鲎试剂不同批次的一致性。必要时使用细菌内毒素国家标准品和中检院的鲎试剂进行实验。

2、凝胶半定量实验，L为0.5，确定了最小不干扰稀释倍数为2倍，则可以用0.03的鲎试剂做半定量，稀释4,8,16倍做半定量。那越稀释越干扰的样品怎么做半定量？那么这个样品是可以用4,8,16倍直接检测的吗？是不是说明稀释倍数确定了方法就确定了？
答：对于凝胶半定量，相当于同步做了干扰试验。建议仔细看一下实验成立的条件和结果判定方法。越稀释越干扰的说法不成立吧？注意MVD，不超过MVD就可以。若确定采用半定量，则按标准进行不同倍数的实验、计算、判定即可。另注意：即使半定量方法，也要先完成干扰试验（三批样品、三个厂家鲎试剂独立平行实验；原因见红皮书、药典）。

3、2017年的《中国药典分析检测技术指南》写干扰实验是在已有内毒素检测方法的样品出现了干扰，试验室采用了比较特殊的处理方法后，希望验证该方法是否可以有效的排除干扰时使用，是否说明存在一个样品的稀释倍数和鲎试剂都经过确认了，但是，三年后同样工艺的一批样品却不能用这个稀释倍数和鲎试剂却干扰了的情况呢？这种情况，直接重新做干扰实验，证明样品内毒素含量确定就可以吗？
答：这个异常可能与工艺有关，也可能与现用耗材有关。建议首先用以前的不同时段三批留样再次按原验证的方法进行检验，若没有异常则指向现有工艺的可能性大；若无异常需要考虑现有耗材、现工艺的因素排查，建议鱼骨图分析后，考虑合适的正交试验。
    按规定的方法重做干扰试验是可以的，但只能证明你新的方法适用于检验，但没有关联到变更因素或CAPA；建议即时找不到根本原因，也要留样和现有样品同步做干扰试验。

4、2017年的《中国药典分析检测技术指南》中还写到：共6种方法，如果在品种的各论项下没有规定使用哪种方法，则可以使用其中任何一种进行检验。品种的各论下几乎都是写的取本品，依法检查（11432）每1ml样品种含内毒素的量不得过多少EU,那么是不是同一个项目的不同稳定时期的样品可以用不同稀释度和不同鲎试剂检测呢（每次都做干扰实验）？
答：本版药典删除了 凝胶法（1法）作为仲裁方法的规定。标准之前沿用的哪种方法理论上来书还是要用哪种方法，除非进行了方法学实验、报补充申请并经批准。当然，研究一下别的方法还是可以的。稳定性检验，除非有充足的科学理由（知识、文献等等），否则不应该改变检验方法的关键步骤。

附：在百度文库搜索 “细菌内毒素 安度斯”，有相关PPT，请自行学习。
    也可见我的另一个帖子https://www.ouryao.com/thread-524950-1-1.html


如上，若有帮助，请点专业度，或者关闭提问。

歪说歪有李

https://www.ouryao.com/thread-462711-1-1.html  这里有一个2016年的课件，你可以下载看看