衍生化分析方法开发一般思路

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前言

分析方法开发中，遇到一些响应差、极性大或拆分不开的杂质，衍生化分析方法往往是一种不错的选择。通常来说，带氨基（R-NH3）、羧基（R-COOH）、醛基（R-CHO）、酮羰基（R-CO-R）、酯基（R-CO-O-R）、酰卤（R-CO-X）等基团的有机化合物都可以进行衍生化反应。本文主要总结了衍生化分析方法的一般开发思路及一些注意事项。
01衍生试剂的选择及加入量的确定







1）衍生试剂选择衍生化分析方法开发极大依赖于化合物结构，需要结合化合物官能团、检测器、灵敏度、专属性等因素综合选择衍生试剂。我在《杂质响应差、极性大、拆分不开？柱前衍生法了解一下》一文中列出了大部分常见官能团的衍生案例，有兴趣的同行可以在注册圈查询作为一个参考。
衍生试剂通常的选择原则是：易得，与待测成分快速反应，衍生产物满足灵敏度要求，副反应少+反应位点少（即选择性高，通常反应位点越多副产物越多），衍生试剂不干扰衍生产物的检测、副反应产物不干扰待测衍生产物的检测、对色谱柱及精密仪器损害小（若有损害，如酰氯，反应需经过淬灭处理）、低毒或无毒、环保等。常见的衍生化试剂：硅烷烃类、苯肼类、酰卤类、手性衍生试剂（如Marfey’s、脯氨酸等）等都非常常见且易购得。
2）加入量的确定衍生反应需要结合反应机理按摩尔比投料计算衍生试剂浓度，如果主成分也会被衍生，则以主成分折算衍生试剂浓度，如果主成分不被衍生，则以杂质折算衍生试剂浓度，计算出衍生试剂的最低需求量，在此基础上结合反应情况灵活设计浓度及加入量。做加入量考察时，建议配制的加标溶液要按回收率验证的上限浓度加标后进行考察，例如150%、200%，以保证衍生试剂加入量能满足方法学验证的高浓度需求。
02衍生方式的选择







样品的衍生方式主要分为柱前衍生和柱后衍生，柱前衍生又分为在线衍生（即程序进样）和线下衍生。柱后衍生通常为在线衍生。下表中列出了三种衍生方式各自的优缺点，总体来说，程序进样和柱后衍生都比较便利，但局限性较多；柱前-线下衍生方式局限少，在方法开发上相对应用范围更广，但操作更为复杂；柱后衍生专属性更强。衍生方式必须要结合衍生化反应的特点选择适宜的方式。

衍生方式	柱前-程序进样
简介	程序进样即利用精密仪器（HPLC、UPLC、GC）的程序进样设置，使用仪器分别自动吸取一定体积的样品、衍生化试剂（固定进样位置）、催化剂（固定进样位置），在线停留短时间进行衍生化反应（HPLC主要在定量环中反应，GC在进样针中），转化为衍生化产物，然后自动进样经过色谱柱进行分离检测。
优点	效率高，重复性好，简化实验操作，减少工作量，减少人为干扰因素。
缺点	衍生试剂和反应溶剂、衍生条件的选择有较大局限性，不适用于需要高温加热的衍生反应；要求衍生反应迅速；软件操作更复杂，有特定检测设备（HPLC、GC等）和软件要求，色谱条件优化较柱后衍生复杂。
举例	吴海智，肖玥惠子，朱礼等，程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法测定乳制品中牛磺酸含量[J].食品研究与研发，2021年11月，第42卷，21期，116-120。

衍生方式	柱前-线下衍生
简介	通过人工方式进行线下衍生化反应，转化为衍生化产物，直接进样或经过一定的样品后处理再进样，经过色谱柱进行分离后检测或直接于其他检测设备检测（如紫外-可见分光光度计）。
优点	应用范围广，对衍生试剂、衍生时间要求宽泛，无特定检测设备要求，可以对衍生副产物进行预处理。
缺点	工作量多，实验设计上需要考虑人为操作差异。
举例	《中国药典》2020版二部 正文品种复方氨基酸注射液（18AA- Ⅲ）含量测定

衍生方式	柱后衍生
简介	首先使用色谱柱将化合物实现分离，再利用柱后衍生反应使被测物与相应的试剂分析反应，生成的衍生化产物再进入检测器检测。目前常见的做法一是在色谱柱后加装反应管（可以自行开发，也可以购买一些适宜的市售的柱后衍生柱/包）；二是专门的柱后衍生化系统。
优点	效率高，专属性强，简化实验操作，减少工作量，减少人为干扰因素，不改变样品溶液中的化合物分离和保留行为，相对更便于做杂质追踪。
缺点	衍生试剂和反应溶剂选择有较大局限性，加装反应管的柱后衍生法不适用于需要高温加热的衍生反应，有检测设备要求（HPLC），要求衍生反应迅速，可能有样品扩散问题；因为在线反应环境为流动相，所以要适应衍生反应从而可能对流动相体系的选择有一定的限制。或者需要开发专门的柱后衍生化系统，增加研发费用。
举例	加装反应管：食品安全国家标准，婴幼儿食品和乳品中维生素 K1 的测定，在柱后接入锌还原柱进行衍生化反应。柱后衍生系统：张丽，朱姝等，高效液相柱后衍生法测定食品中黄曲霉毒素B1，Chinese Journal of Health Laboratofy Technology，2006，16，70.

03反应溶剂及样品稀释剂/萃灭剂的选择







1）反应溶剂衍生反应溶剂服务于衍生化反应。反应溶剂主要分为以下四种情况，主要结合衍生机理及化合物溶解性、色谱体系几方面进行选择。例如烷基化或酰基化反应，必须在非质子溶剂中进行反应，则需要结合样品溶解性选择反应溶剂/样品溶剂。

非质子非极性溶剂	甲苯、乙醚、四氯化碳、正己烷等
非质子极性溶剂	乙腈、DMF、DMSO、二/三氯甲烷、丙酮等
质子溶剂	含有-OH，-NH2等，如甲醇、水、异丙醇等
衍生试剂本身	衍生试剂本身为液体，如苯甲醛、异硫氰酸苯酯等，通常本质上是质子溶剂，即有较强反应活性

反应溶剂的选择原则上是不与衍生化试剂及待测物反应（衍生试剂本身做溶剂除外），能溶解待测物和衍生化试剂，对衍生产物的色谱检测不产生干扰；如果要进入精密仪器系统，对色谱柱、精密仪器损害小，与流动相互溶；低毒或无毒、环保等。              

2）稀释剂/萃灭剂稀释剂服务于检测系统。主要结合色谱检测系统和衍生产物溶解性选择。稀释剂和反应剂可以相同也可以不同，主要作用是萃取样品或稀释样品。稀释剂的主要原则是必须溶解衍生化产物，对色谱柱、精密仪器损害小，低毒或无毒、环保。
淬灭剂服务于衍生反应，萃灭剂和稀释剂可以相同可以不同。如果淬灭剂同时作为稀释剂使用，则需满足稀释剂的要求。

稀释异味大或对精密仪器可能有腐蚀作用反应溶剂	例如衍生反应需要非质子溶剂环境（二氯甲烷、乙醚等），二氯甲烷和乙醚之类溶剂或异味大、或对反相精密仪器的管路可能有腐蚀作用，在满足溶解度的情况下，稀释剂最好更换为乙腈、醇类（甲醇、乙醇、异丙醇等）、水等,使反应溶剂稀释后减小进入精密仪器的量。
萃取衍生产物	例如衍生反应在水相中进行，但是检测系统为GC直接进样或者正相HPLC，则需要取与水不互溶但溶解衍生产物的溶剂萃取衍生产物。
解决溶剂效应	例如以甲醇做反应溶剂，进样分析发现溶剂效应严重，则可以将稀释剂换成水或一定比例的甲醇水混合溶液。
萃灭反应	一些始终较难达到反应平台的衍生反应，通常以除去或消耗多余衍生试剂，或中和反应催化剂等方式使反应停住。例如酸催化加入碱中和催化剂，加水或醇消耗多余的酰氯衍生剂，用正己烷从水相中萃出大部分异硫氰酸苯酯等。

04催化剂的选择及用量






催化剂服务于衍生反应，其极大依赖于衍生反应机理。常见的衍生化反应的条件为室温直接反应、酸性或碱性条件、加热、光照催化、氧化、还原等。酸性条件如盐酸溶液、醋酸溶液，碱性如三乙胺、二乙胺、碳酸氢钠溶液等。催化剂的选择原则是易得，根据衍生反应速率、反应副产物多少选择适当活性的催化剂，反应慢就选择强一点的酸或碱，反应体系副反应太多就选择弱一点的酸或碱，但催化剂浓度不会使衍生化试剂和被测物降解。
大多数的催化剂是循环参与反应，催化剂的用量通常不宜过多，根据反应速率及系统副反应情况进行选择即可。但也需考虑部分反应中：催化剂除开催化反应，可能还有别的作用，如三乙胺做催化剂，除了本身催化反应外，还会作为缚酸剂，需要考虑这部分消耗。此外如果主成分带反式盐，需要考虑反式盐对催化剂的消耗。例如盐酸盐、三氟乙酸盐等，会消耗掉碱性催化剂，则催化剂的用量需要根据摩尔浓度将反式盐酸盐中和的量折算掉，比较简易的做法是直接测反应溶液的pH。
05衍生反应投料顺序






衍生反应投料顺序同样要结合反应机理进行设计，投料顺序不同可能终产物不同，或者副反应程度不同。大体投料分成以下4种情况需要注意，反应机理如果没什么特殊要求的反应，则随便选择投料顺序：

样品+衍生试剂	这种方式通常是衍生试剂非常活泼，可以快速将样品进行衍生，通常不需要催化剂，例如酰氯作为衍生试剂衍生醇、羧酸、醛、酮等。
样品+催化剂和衍生试剂混合溶液+其他催化条件	这种方式减少溶液配制工作，但必须满足催化剂条件下衍生试剂自身不会反应或降解，例如两分子醛在稀碱条件下会自身反应缩合，所以用醛做衍生试剂时就不宜与催化剂预先混合在一起。
样品溶液+催化剂+衍生试剂+其他催化条件	这种方式溶液配制会相对麻烦一点，主要顾虑是反应专一性问题。有些反应不同的投料顺序会造成终产物不同，如下图。
样品溶液+衍生试剂+催化剂+其他反应条件	待测物在催化剂作用下会自身发生反应时适用于该种投料方式，例如烯烃在酸性条件下自身就会先发生缩合反应，这种情况就需要先将样品与衍生试剂先混合提高反应的专一性，再加入催化剂/其他催化条件。

06衍生反应时间考察






许多有机反应要达到100%反应终点的概率极低，所以衍生反应时间以衍生反应达到平台即可或使用一定手段萃灭终止。配置加标溶液进行衍生（加标量最好覆盖回收率验证的最高点，如限度的150%，200%），在适宜温控条件下（如40℃或室温）待衍生反应达到平台即可。
07衍生反应温度选择






衍生反应温度建议不要太高，室温~60℃。如果以室温反应，最好详细记录每次衍生实验的环境温度，出于可控性和细节操作性，建议规定反应温度。温度不宜过高，过高容易引起化合物降解或挥发，不安全，且通常为了方便定容，发应容器通常选择量瓶，反应器皿为量瓶时温度不宜超过60℃。温度选择的原则是：不引起化合物降解产生过多干扰或待测物挥发或副反应过多，反应快速进行。
08样品后处理






该项仅适用于线下柱前衍生。出于对色谱柱的保护，建议衍生反应溶液过滤，则需进行过滤吸附考察。空白溶液、灵敏度溶液、对照品溶液以及供试品溶液都建议考察。各位同行应该对过滤吸附考察并不陌生，在此不再赘述。如果反应体系过于复杂，可以考虑对反应溶液进行后处理，如超滤除去较大分子量的干扰，固相萃取，过柱等。
09计算方式选择






被测物含量计算方式常见的主要分为两种：①反应转换率非常高，衍生产物容易获得，可将衍生产物标定为对照品，配置外标对照品溶液以外标法计算；②反应转化率不高，则以被测物标定为对照品，配置对照品溶液，与供试品平行衍生，用衍生对照品溶液以外标法计算。
10色谱条件






色谱条件与常规的有关物质分析方法一样的思路，笔者在此不做赘述。衍生化反应体系通常都比较杂，干扰较多，色谱条件需要结合衍生试剂、催化剂等一起开发。如果衍生试剂或催化剂引入的杂质太多，则更换纯度更高或级别更高的试剂。如果是衍生试剂或其他杂质始终干扰衍生产物检测，则考虑更换衍生试剂，直到满足专属性为止。柱后衍生需要注意流动相种类、流速等，需要考虑要给衍生反应留有足够的时间但又不会引起过于严重的扩散。
11方法学验证






衍生化分析方法的验证同样遵循ICH Q2 Q2(R1): Validation of Analytical Procedures Text and Methodology、《中国药典》2020版四部指导原则 <9101 分析方法验证指导原则> ，在此不做赘述。只提几个注意的点。
专属性验证常规的专属性结合强降解实验进行。如果衍生化分析方法专属性非常强，可以结合强降解进行验证；如果分析方法专属性不够强，可以不选择强降解的方式，结合稳定性效期末点的样品、影响因素30天样品、GLP批次样品、代表性的工艺样品等进行验证。关注衍生物峰纯度、相邻峰分离度、波谱吸收图。
LOQ验证溶液的设计衍生化分析方法的LOQ，除开化合物本身的LOQ浓度，还有衍生方法的灵敏度。我见过同事LOQ验证溶液是直接以衍生后STD溶液稀释制备，或直接称取衍生产物对照品配制，我个人觉得这是不太合理的做法。这两种方式本质上都是稀释了背景，且考察的不是分析方法衍生能力的检测灵敏度。最合理的验证方式是配制LOQ浓度的待测物进行衍生后检测。如果LOQ溶液的SN远大于10，分析方法操作SOP中的灵敏度溶液可以设计成“衍生后STD稀释”或“以衍生产物对照品配制”，但是如果SN接近10，则灵敏度溶液应设计成与样品、对照品同步衍生的方式制备。
线性溶液设计衍生方法的线性验证也基本是同时考察衍生反应的线性以及衍生产物自身的线性，所以合理的线性验证方式应该是配制各线性浓度的待测物溶液，经拟定的分析方法衍生后进样分析。我见过有同事制备1份高浓度贮备液经拟定的分析方法衍生后，将该溶液按不同比例稀释后进样分析，进行线性验证。这是一种讨巧的办法，并不严谨及科学，我个人不太推荐。这只是证明了衍生产物本身具有良好的线性，并不能证明在基质存在的情况下，衍生反应是呈现线性反应的。
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太阳风暴0393

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