淋洗水回收率很低

哇唧唧哇2837

各位老师们，用动态显色法测试亲和层析柱（带填料）淋洗水和CEX层析柱（带填料）淋洗水时，回收率很低，回收率为48%和36%，相关系数是1，CV值也是在2%以内，是什么原因呢？

机智鼠

针对您提出的淋洗水回收率低的问题，可能的原因及分析如下：

1. **层析柱性能**：亲和层析柱和CEX层析柱的填料性质、孔径分布及结合容量可能影响淋洗效率。需检查填料是否均匀、有无堵塞或老化现象，确保其符合产品说明书要求。

2. **操作参数**：淋洗流速、缓冲液组成（如pH、离子强度）及温度等参数设置不当可能导致蛋白与填料结合过强或解离不完全。建议参考《中国药典》三部通则3405“层析法”优化条件。

3. **样品特性**：目标蛋白的分子量、等电点及疏水性可能影响吸附/洗脱行为。需确认样品与填料的适配性，必要时调整缓冲体系或更换填料类型。

4. **系统残留**：管路或层析柱中可能存在死体积或残留蛋白，导致回收率偏低。建议进行空白对照实验，并验证系统冲洗彻底性。

5. **检测方法**：动态显色法的线性范围、标准曲线准确性及仪器稳定性需核查，排除定量误差干扰。

综上，建议从填料性能、操作参数、样品适配性及系统验证等方面逐一排查，必要时参照《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》进行方法学验证。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

wzzz2008

说明低的很稳定？

世间始终你好

你提到用动态显色法测试亲和层析柱和CEX柱的淋洗水时，出现了：

• 回收率低（亲和柱 48%，CEX柱 36%）
  
• 相关系数 r = 1，说明线性非常好；
  
• CV < 2%，说明重复性也很好。
  
  

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这类现象很典型：定量方法本身稳定可靠，但样品中被测物未能完全被检出，即发生了**“隐藏损失”**或“检测盲区”。

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一、回收率低的核心可能原因类别可能原因说明
1. 被测物吸附或结合淋洗水中仍残留部分蛋白或染料被填料、管路、过滤膜等吸附特别是在含有未中和pH或高盐环境时，某些蛋白质可能重新吸附到介质或设备
2. 动态显色法对某些形式不敏感显色试剂未能检测变性蛋白、结合态蛋白或游离态比例偏低某些蛋白在淋洗水中已变性或部分聚集，导致检测值偏低
3. 显色体系与淋洗液不兼容淋洗液成分抑制了显色反应，例如高盐、胍盐、醋酸、低pH等某些显色法如BCA、Coomassie等对溶液体系敏感，抑制显色反应，导致回收率虚低
4. 溶液中有干扰物质缓冲液残留物或其他组分干扰吸光度测定（造成信号偏低）比如imidazole、NaCl等对低浓度蛋白的显色有抑制作用

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二、你可以从以下角度排查1. 使用不同浓度的标准物加入到同一样品基质中，做回收率实验

• 模拟添加（spike-in）你原始蛋白质或显色物，在相同的淋洗液中
  
• 如果加标回收率仍低，说明基质抑制是主要问题
  
• 如果加标后回收率正常，说明是样品中蛋白本身损失或变化
  
  

2. 检查淋洗液组分是否抑制显色反应

• 比如亲和柱常用imidazole，CEX柱常用高盐/低pH缓冲液
  
• 使用相同组分加到显色标准液中，是否信号下降？
  
• 尝试稀释样品或用透析/脱盐后再显色
  
  

3. 尝试更换显色方法

• 你没说明是哪种动态显色法：Lowry？Bradford？BCA？
  
• 不同显色方法对基质耐受性差异很大，例如：
  
  
  • Bradford 易受高盐/去垢剂干扰；
    
  • BCA 容忍非还原剂较强，但受还原剂、螯合剂影响；
    
  • UV280 不受缓冲液影响，但对纯度要求高
    
    

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三、举例分析：比如亲和柱（Protein A）淋洗液：

• 常用低pH淋洗（pH 3~4）
  
• 蛋白质可能部分变性、聚集、结合到柱子或过滤膜上
  
• 显色法对变性蛋白检测效率可能降低
  
  

比如CEX柱：

• 常用高盐梯度（NaCl）或pH变更
  
• 高盐/极性缓冲盐会抑制显色反应
  
• 或者蛋白质在低pH下沉淀，造成检测损失
  
  

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结论及建议项建议
回收率低但R=1、CV<2%说明方法本身稳定可靠，但样品存在未被完全检出的组分
建议1做标准加样回收实验，明确是方法干扰还是样品损失
建议2更换或优化显色方法（如改用BCA、紫外法、稀释脱盐后再显色）
建议3检查缓冲液成分对显色是否有干扰
建议4检查过滤、离心、吸附等环节是否有蛋白损失

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